核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN)，与染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测一样， 是一项用于在细胞天然染色质环境下检测蛋白-DNA 相互作用的强大通用技术。该技术自2020年问世以来，以所需细胞量少、背景低、易操作等多种优势，被广大科研工作者所青睐，也收到了来自终端用户的操作细节问题及经验，今天天特别共享给大家。
本文特别感谢中国医学科学院血液学研究所王建祥、王敏团队刘钰同学整理问题，CST技术专家详细解答。
PART 1 CUT&RUN实验基本步骤
以CST 备受欢迎的CUT&RUN试剂盒#86652为例：首先将细胞固定在伴刀豆球蛋白A磁珠上，然后用洋地黄皂苷通透细胞膜，加入一抗和pAG-MNase（Protein A-Protein G-微球菌核酸酶），一抗募集pAG-MNase到靶蛋白上，0度条件下添加Ca2+激活pAG-MNase，并切割靶蛋白两侧的DNA，使其从基因组中释放出来，扩散到上清中。上清中的DNA纯化后进行qPCR或NG-Seq鉴定、定量。
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PART 2 CUT&RUN细节灵魂问答
1.Input样本问题
问：对每组的3-4个生物学重复样本，需要分别设置input对照吗，必须要和目的抗体组同样的细胞数吗？因为所用原代细胞比较珍贵，如果这样的话就要拿出相当一部分的细胞来做input对照？
答：生物学重复不需要，不同处理组需要。Input需同样的细胞数。
问：Input没有切出来100-600bp大小，是超声的问题吗？还是加错试剂了？
答：有可能超声不够，DNA没有释放出来；或者纯化后丢失；或者qPCR的过程有问题。片段很大的话无法被柱子回收，要用酚氯仿抽提。超声建议接触式超声（官网步骤），使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理，可充分碎裂input染色质。（测试不同的超声仪功率设置和/或超声处理持续时间来凭经验确定）。
问：Input这里染色质打断的原理是什么呢，DNA extraction buffer会有破膜的功能吗，不然只有DNA extraction buffer再加一个超声真的能打断吗？
答：DNA extraction buffer是有有破膜的功能的，input样品的片段化，就是在buffer里超声。
问：Input样本超声后有泡沫、温度有些高有影响吗？还是说只要跑胶后片段大小在100-600bp即可呢？
答：无影响，超声打断染色质即可(目的不是收蛋白)尽量避免，可以下调amplification。
问：后续用于建库的input量一般选择多少呢？5ng？
答：input提供的是样本中DNA（未经cut&run）的整体信息，足够建库即可，5ng是足够的。Input量较多，有5ng即可。
问：超声后误吸到沉淀会对后续的结果有影响吗？
答：尽量不要吸到沉淀。如果吸到了，就再离心一次，不要吸到沉淀。沉淀可能影响ligation。
2.活细胞制备：
问：温热200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 和 100X 亚精胺 #27287，室温还是37℃？融化后如何保存，是室温放着？
答：是的，-20℃取出后置于室温，可轻弹管子促进溶解。待完全溶解混合均匀后再取用。完成后建议冻回-20℃，短时可置于冰上/4度冰箱。
问：活细胞制备：洗涤缓冲液总体积如何配制？input里面不需要蛋白酶抑制剂混合物和亚精胺，为什么？亚精胺作用是什么？
答：洗涤缓冲液总体积计算：每个细胞系（或者样本） 2 ml，每个反应或每份input样品额外准备 100 µl，比如有一个样本，有阴性对照、阳性对照、实验组三个反应+一个input，就需要2.4ml 洗涤缓冲液。input的目的是提全部DNA，对DNA和蛋白相互作用的保护并不Care，所以可以不加蛋白酶抑制剂混合物和亚精胺的。亚精胺作用是对DNA和蛋白相互作用的保护。替代了Mg离子，在正常CR实验后续需要有Mg， 来帮助内切，因为Mg会影响DNA稳定性，所以用这个替代。
问：细胞准备完毕后可以在4℃放置一段时间吗？还是要立即进行ConA珠子和一抗的结合呢？
答：不能4℃，只能常温。活细胞就先做conA活化，放冰上等样本制备好，尽量不要让活细胞stress（珠子等样本，而非样本等珠子）。
3.ConA beads和一抗的结合：
问：ConA beads用枪吹匀就可以吗？
答：是的，轻柔混匀，不要震荡。
问：ConA beads提前制备后放在冰上时间久了会有结块或者磁珠析出，用移液器吹打后可混匀，请问这样有影响吗？
答：没有影响。跟样本混合前，不是析出，只是珠子的沉降。
问：Digitonin buffer取出后在100℃放置10min后仍可以看到白色悬浮颗粒，请问这样是可以用的吗？还是需要延长100℃时间呢？放到冰上后可以看到有白色沉淀在底部，是可以直接用的吗，还是要怎样使其溶解呢？
答：延长时间溶解，时不时晃，必须保证digitonin完全溶解后再使用，否则会影响破膜效率及后续抗体，MNase切割和染色质的充分释放。可通过适当延长孵育时间保证其完全溶解。溶解后放4℃。
问：在整个的实验过程中，比如4℃ 1h等，期间Digitonin buffer可以一直放置在冰上吗？还是要放回-20℃再重新解冻呢？
答：一天protocol，可放4℃。两天放-20℃。
问：4℃孵育一抗过程中，在旋转后会有beads析出或者挂到侧壁的情况，用移液器吹打后可混匀，这种是可以的吗？一抗孵育的时间2h和过夜哪个更好呢？一抗时间越长越好吗？
答：珠子结块是正常现象，结块不会影响实验结果。如果不想结块，可以选择静置孵育(Rotate可能会增加结块的可能性，但不会影响结果)，静置会看到沉降，也不影响结果。如果不放心，可以摇晃或者rotate。
一抗时间都可以，取决于时间安排。
4.pAG-Mnase酶结合：
问：4℃旋转1h，可延长吗？
答：1h已可使pAG与抗体进行结合，延长没有明显意义。
5.DNA消化和释放：
问：Spike-in DNA在NGS测序中是必须的吗？是qPCR中是必须的吗？
答：根据需求使用，spink in 不是必须的。
问：stop buffer室温化还是冰上化呢？
答：Stop buffer中有个物质，较为sensitive, 室温化，看到稍剩一点冰后，晃晃放冰上。
6.建库：（#56795 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina/ E7645 NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®）
建库前准备
问：AMpure beads和SPRI Select beads有区别吗？为什么AMpure beads至少需要提前在室温放置半小时呢？
答：没有区别，beads在常温下效率高。
问：End prep enzyme mix和End prep enzyme buffer是可以室温化吗？
答：前者不会冻起来，冰上，不可常温。buffer可以常温，vortex完全化开。
问：制备1XTE中1mM EDTA是必须的吗？作用是什么呢？
答：不是。起始DNA在TE中，故接着用TE。EDTA也可以换tris hcl。
接头蛋白连接
问：针对Cut&Run后无法定量的样本（低于Qubit检测范围），目前没有更微量仪器，如何稀释adaptor和选择PCR扩增循环数呢？有对应于细胞数的PCR循环推荐吗？比如我们现有5X10^4细胞，选用抗体为#9733 H3K27me3、#8173 H3K27ac、#9751 H3K4me3，可以选用怎样的稀释比和循环数呢？
答：产量靠经验，但也取决于Ab效率。
50K细胞，15-18 cycle ，根据Library DNA 浓度调整，library DNA浓度在10-30ng/uL都可以（如果没有picogreen，只能根据Library DNA 估算）。
需要Picogreen，用最多的20cycle, 或者先P12-14cycle，取2uL picogreen测浓度。不可用nanodrop，nanodrop需纯DNA。
问：Input的adaptor稀释问题：是根据实际的DNA浓度进行稀释还是选择和目的抗体样本管相同的adaptor稀释比呢？
答：根据实际浓度。
问：PCR仪的盖子设置为≥47℃，有具体的上限要求吗？是越高越好吗？
答：不是，盖子要高于酶切反应的37度，防止evaporation。47℃即可。
问：DNA end prep：推荐Cut&Run样本用到的20℃ 30min，50℃ 30min是适用于所有细胞量的吗？组蛋白、 转录因子都可以用这个条件吗？期间热盖温度应该设置多少呢？
答：跟细胞量无关，跟片段大小有关，适用于所有的cut run 片段。温度太高可使dna变性。根据protocol设置热盖。
片段清除
问：两步片段纯化中推荐的1.1X 纯化beads是适用于所有细胞量的吗？0.9X纯化beads你们有测试过吗？组蛋白、转录因子都可以用这个条件吗？
答：与DNA片段大小有关，buffer中APG的量决定了回收的是小片段还是大片段，浓度越高，回收的片段越小。CUT&RUN产物连adaptor 在200bp,左右 故1.1X OK。
问：开盖晾干beads的过程中如果晾干不够会对测序结果有影响吗？
答：乙醇影响PCR,太干损失DNA。Fang的操作：吸取上清后，开timer 5min，用小枪头再吸一遍（一般可以吸走2-3uL），等Timer到时间，加TE。
PCR扩增
问：对应于input样本可以选用相同的cycle数吗，还是根据所用的实际量比如5ng进行选择呢？
答：input根据实际量。见56795新版protocol。
问：PCR循环数设置中17cycle以上都需要进行分两步PCR吗？是因为Q5酶活性只能到达一定的cycle吗？两步中间需要定量吗？
答：最多20个循环，不做两次扩增了。
问：PCR扩增cycle数过多会有影响吗？
答：PCR会影响低丰度Peak不被读取（优先P高丰度），故Library DNA的量需控制。
问：如果按照上述分两次进行扩增，第一次扩增后也是选用1.1Xbeads进行纯化最后取15ul加到PCR体系吗，体系其它的量都是一样的是吗? 期间需要进行定量吗？
答：不做两次扩增了。
问：退火延伸时间是将建库kit里推荐的75s改为13s用于Cut&Run样本是吗？13s的退火延伸时间是适用于所有细胞数所有蛋白吗？
答：13s可以足以扩到1KB，希望小片段得以扩增，而非大片段。（10-15sec都可以）（此方法作为size selection的替代）
问：终末延伸65℃ 5min是适用于所有细胞数所有蛋白吗？
答：跟细胞数无关, 65℃ 3min也可。
问：该扩增条件对于input样本是和目的样本一致的吗？
答：是的。
PCR纯化
问：#56795里提到最终得到的DNA库的浓度10-40ng/ul是对应于多少细胞数呢？
答：5万-10万细胞所得浓度差不多，都应该到这个量。
问：具备多少量是可以送测序的呢？
答：10-40ng/uL， 应足够测序量（测序是nM级），测序公司希望收到浓样本，以便定量和由他们稀释。
问：推荐的测序深度是多少呢(我们用到的是双端测序)？
答：3-5M(protocol), 或者5-8即可。（M-million reads）如果希望最少的3M,则target 5Million,以平衡pippet和操作误差。
问：Protocol里写到的稀释所建DNA文库至5-10ng/ul是必须的吗，因为我们比较担心会和测序公司的质控浓度有偏差？
答：这是Bioanalyzer测试所需的浓度，5-10是较妥的。
测序质控及分析问题：
问：对于Bioanalyzer质控，组蛋白峰应该在什么位置是正确的呢？选用抗体为#9733 H3K27me3、#8173 H3K27ac、#9751 H3K4me3，对于转录因子峰应该在多大处呢？
答：300bp左右。转录因子200-300。
问：如果存在接头污染的问题也是可以上机的是吗，接头污染的peak和目的peak在Bioanalyzer质控中是可以区分的吗，接头污染的峰在什么位置呢？
答：接头污染可导致reads拿到的几乎都是接头。一点点污染可以接受，如结果中有5% adaptor也OK。可以区分。
问：Cut&Run的后续分析和chip-seq的后续分析是相似的吗？是否有推荐的pipeline呢？
答：IGV track等操作一样，分析可以尝试Henicoff的软件, 或其他。
