【小优细节君】如何做出漂亮的PD-L1条带？

PD-L1相信大家都不陌生了，研究肿瘤的同学们，往往都要观察一下它的表达变化，或者想着法儿去抑制。如果没接触的同学们也别着急，通过这篇文章的介绍，大抵也能尝试做做。

PD-L1
全名叫程序性细胞死亡蛋白 1 配体 1(Programmed cell death 1 ligand 1)，也称为表面抗原分化簇274(Cluster of differentiation 274，CD274)或 B7同源体1(B7 homolog 1，B7-H1)，由CD274基因编码，是细胞表面配体 B7 家族的一员。那么它是怎么被发现的呢？

其实首先发现的是PD-1。1992 年 Y·Ishida 及其团队在研究细胞凋亡过程中发现肿瘤免疫环境内还存在一种特殊受体，并将这种抑制T细胞免疫活性的分子命名为细胞程序性死亡受体（programmed cell death protein 1，PD-1，CD279）。2000年 Y·Ishida 联合哈佛大学医学院丹娜法伯癌症研究院共同发表了以 PD-1 肿瘤免疫理论为基础的重要论文，继抑制T细胞免疫活性的受体分子后又发现B7蛋白家族配体细胞程序性死亡配体1，阐述了 PD-1 /PD-L1 参与调控 T 细胞分泌细胞因子的作用过程。

从此，PD-1/PD-L1信号通路便一发“不可收拾”，成为研究肿瘤免疫逃逸和治疗的热点。

图1 B细胞和T细胞中的PD-L1/PD-1信号传导

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如上图所示，在肿瘤细胞上表达的PD-L1可与免疫细胞的PD-1受体结合，促进免疫细胞的失活或凋亡，使肿瘤细胞免疫逃逸和增殖。PD-1/PD-L1的相互作用还会抑制免疫细胞内的信号转导，下调免疫刺激性细胞因子的分泌，增加免疫抑制性细胞因子的产生。 

在许多癌症中，肿瘤固有的PD⁃L1 信号通路通常处于异常激活状态。PD⁃L1 异常激活的机制有很多，例如基因组改变（扩增和调节）、组成性癌基因信号激活（MYC、RAS、EGFR）、外源性因素（IFN-γ、TNF-α、EGF、IL-17、IL-27）、表观遗传机制（miRNA、异常的DNA甲基化和组蛋白修饰）。另外，肿瘤微环境中存在的某些炎症因子也会诱导 PD-L1 异常表达，加速 PD-L1 与 PD-1 相互作用，最终使免疫细胞耗竭无法完成免疫调节。可见PD-L1的调控不仅仅某一单一因素，正是这种表达的多样性，使得 PD-L1 成为了人们关注的焦点。

图2  PD-L1 的表达调控

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那么我们介绍了PD-L1，怎么样才能做出漂亮的WB条带呢？

01 确定好的研究对象

有一个合适的研究对象，实验就成功了一半。研究表明， PD-L1 在黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和肾细胞癌等许多肿瘤类型的细胞中表达。PD-L1 在癌细胞中的表达与肿瘤浸润性淋巴细胞有关，可通过释放IFNγ介导 PD-L1 表达。也有研究表明 PD-L1 表达与病毒感染相关癌症有关。

虽然PD-L1在许多癌细胞中表达，但不代表每种肿瘤细胞都能检测到PD-L1的表达。因此，在选择某种特定细胞进行探究实验时，最好先查阅文献和数据库看看是否有足够的表达量。也可以同时使用表达量高的细胞样本（如HDLM-2、MDA-MB-231）或者肺癌组织作为阳性对照来进行实验。如果HDLM-2、MDA-MB-231这些细胞难以获得，可以采用IFN-γ诱导的方法，剂量和时间可以依据参考文献。

图3 THE HUMAN PROTEIN ATLAS中PD-L1在各种细胞系的表达量

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02 制样时要超声

如果样本中PD-L1的表达量不高，裂解细胞的时候加以超声，有助于断裂染色质，同时增加蛋白的可溶性。对于主要表达在膜上的PD-L1，更容易使抗原表位充分暴露出来，与抗体结合更容易。

超声的方法也比较简单，细胞或组织裂解后，置于冰上，超声条件是10-15s，3 次(期间每次间隔10s)，超声频率是30%－40%，电流30A; 如果没有超声仪，可以采用1ml 带针头的注射器冰上反复抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸为止。

03 裁膜范围要宽

取什么样的裁膜范围合适呢？这要根据PD-L1的分子量和修饰情况来定。

PD-L1全长290个氨基酸，分子量约33kDa，由于剪切可产生2个异构体，所以有时做Western出两个条带也不要诧异。

PD-L1的活性和稳定性受到各种PTM的调控。糖基化和棕榈酰化对于维持 PD-L1 的稳定性至关重要。此外，糖基化还会影响 PD-L1 和 PD-1的结合。由于PD-L1含有多个糖基化修饰位点，在不同样本中，糖基化修饰的水平不一致，我们实际观察到的条带位置也不在33KDa，通常在40-50kDa，所以各位同学裁膜时要包含30-70kDa的区域，足够涵盖绝大部分情况了。

图4 PD-L1的翻译后修饰现象

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04 mRNA表达水平仅能作为参考项

PD-L1的mRNA水平与蛋白质表达水平可能不一致。

下图文献中虽然正常细胞检测到了mRNA的表达，可以确定该剂量药物的诱导下，mRNA水平显著上升，但是由于WB的灵敏度问题或者蛋白表达水平低，WB实验中还是没有检测到正常细胞的PD-L1，最后是通过过表达才能检测到条带。

图5 PD-L1在AGS、SNU-719的表达水平

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参考文献：
1.Xianjie Jiang, Jie Wang, Xiangying Deng et al. Role of the tumor microenvironment in PDL1/PD-1-mediated tumor immune escape. Molecular Cancer (2019) 18:10.
2.Junzo Hamanishi，Masaki Mandai, Noriomi Matsumura et，al. PD1/PDL1 blockade in cancer treatment: perspectives and issues. Int J Clin Oncol (2016) 21:462–473.
3.Jong-Ho Cha1, Li-Chuan Chan, Chia-Wei Li et al. Mechanisms controlling PD-L1 expression in cancer. Mol Cell. 2019 November 07; 76(3): 359–370. 
4.宋若飘，臧爱民，贾友超. PD⁃L1在肿瘤细胞中表达调控机制研究进展. The Journal of Practical Medicine 2020 Vol.36 No.10.