【小优细节君】关于JAK激酶，你需要了解的二三事

提到JAK，不得不提一下研究最多的JAK/STAT信号通路。JAK/STAT通路是一种高度保守的信号转导途径，它调节与各种疾病发展相关的多种细胞机制，被认为是细胞功能的中心通信节点之一。在骨髓增殖性疾病、结肠炎等多种疾病的相关研究中，都扮演着核心角色。

JAK

JAK是细胞质非受体酪氨酸激酶（Janus activated kinase，JAK）。它们最初被命名为“just another kinase”1和2（因为这只是基于PCR的筛选发现的大量激酶中的两个），但最后发表为“Janus kinase”。Janus这个名字起自罗马神话中代表开始与结束的两面神雅努斯，因为JAK激酶具有两个几乎一样的转移磷酸基团的结构域。其中一个结构域表现出激酶活性，而另一个结构域调控第一个激酶的活性。

1989年，Wilks等人确定酪氨酸激酶具有可识别的激酶结构域和假激酶结构域。1991年，他们发现了第二个具有这种特征的酪氨酸激酶，Wilks称之为JAK1和JAK2。其他两种JAKs，酪氨酸激酶2（TYK2）和JAK3，分别于1990年和1994年被鉴定出来。

1992年，当时Velazquez等人发现TYK2是IFN-α/β信号通路中的一种基本蛋白。而Müller等人发现，IFN依赖性信号需要JAK磷酸化STAT。因此，在90年代，JAK/STAT信号通路的组成部分和轮廓已经完成。对JAK/STAT通路的更多蛋白质和功能的研究一直持续到现在，目前JAK/STAT信号通路中已鉴定出50多种细胞因子和生长因子，如激素、干扰素、白细胞介素和集落刺激因子。

 JAK/STAT信号通路 

经典的JAK/STAT信号通路是如何运转的？首先是细胞配体与其受体相互作用，引起受体二聚体。一些受体可以在与配体结合之前预先形成非活性二聚体，这有助于受体复合物的快速组装和信号转导。配体和受体之间的连接诱导JAK的磷酸化。激活的JAK导致结合受体的酪氨酸磷酸化，形成STAT的结合位点。在这个位点，JAK磷酸化STAT，然后STAT与受体分离，形成同源二聚体或异二聚体。这些二聚体易位到靶基因启动子，从而调节靶基因的转录。

图1  JAK/STAT信号通路

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那么我们介绍了这么多JAK，怎么样才能在WB检测中获得理想的条带呢？

01 确认好的研究对象

JAK家族包括四个成员：JAK1，JAK2，JAK3和TYK2， 他们的组织表达是有差异的，JAK3仅在骨髓和淋巴系统以及内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达，而其他成员几乎在所有组织中表达。这里请注意下，几乎有表达≠所有组织高表达，组织间的差异我们也需要考虑。

如果碰到条带较淡，可以适当增加上样量。一般组织样本上样量推荐50-100ug，细胞样本推荐上样量为20-50ug。

有小伙伴问，我选好做哪个组织了，但是不知道研究哪个JAK，难道每个都要做吗？其实不同的JAK激酶相互作用的细胞因子受体也有所不同，所涉及的疾病也有差异，可以根据图2和图3来选择最佳的研究对象。

图2  JAK相互作用的细胞因子受体

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图3  JAK突变或者异常表达可能导致的疾病

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02 大分子量的电泳和转膜

JAK家族的四个成员的分子量是不同的，JAK1-130 kDa，JAK2-125 kDa，JAK3-115 kDa，TYK2-134 kDa，都属于大分子蛋白。大分子蛋白在WB实验中是有一定难度的，因此在检测时需要更加注重一些细节。

在电泳环节，建议分离凝胶浓度为6%-8%，或者选择4-12%梯度胶，从而获得更好的分离效果和分辨率。在转膜环节，建议采用湿转法，湿转法可以保证大分子蛋白更加充分的转印，图4是湿转和半干转的效果对比。

图4  湿转与快速干转效果对比

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转膜缓冲液中甲醇浓度建议降低至10%以下，转膜液中的甲醇容易让大分子量蛋白沉淀，所以需要减少转膜液中的甲醇含量来避免这种情况发生。另外，还可以在转膜液中添加终浓度为0.1％的SDS，增加大分子蛋白的转移效率。

转膜条件应选择较低的电压并适当延长转膜时间，推荐采用恒压70V，转膜2hr。转膜全程在冰上低温进行，避免因温度升高导致转膜效率降低。转膜结束后还可以使用丽春红染液确认转膜效率。

03 磷酸化检测

在研究JAK时，我们一定也会检测其磷酸化程度如何。前面我们提到JAK几乎在所有组织都有表达，但是磷酸化就不一定了，需要合适的刺激诱导。我们一起来看下需要注意哪些细节：

❖ 使用新鲜样本进行实验，避免蛋白降解及去磷酸化发生。反复冻融的样本很难检测到磷酸化。

❖ 在制样时需要对样本进行适当的刺激诱导处理，如果不知道用什么来刺激，可以根据图2选择合适的细胞因子来刺激。建议先进行预实验，摸索不同浓度时间诱导处理后p-JAK表达水平的变化，选择最佳条件进行后续实验。摸时间和浓度梯度的预实验结果比单点更具有说明力。

图5  文献中研究不同浓度的药物对p-JAK2的影响

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❖ 蛋白提取需全程在冰上进行，保持低温，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以免蛋白发生去磷酸化。

❖ 建议先确认总蛋白的表达后，再做磷酸化的表达。磷酸化只是蛋白的一种修饰，如果总蛋白表达很低或者不表达，磷酸化是做不出来的。还可以通过上下游的磷酸化情况来综合判断，例如细胞因子受体的磷酸化，下游STAT的磷酸化等等。

以上是一些关于JAK的WB检测Tips，当您一直重复实验得不到理想结果时可以根据上述建议进行调整尝试，可能一个小细节的改变就可以帮您得到理想的实验结果。

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参考文献：
[1] Bharath Kumar Gajjela, Ming-Ming Zhou. Calming the cytokine storm of COVID-19 through inhibition of JAK2/STAT3 signaling. Drug Discov Today. 2022 Feb;27(2):390-400.
[2] W J Leonard, J J O'Shea. Jaks and STATs: biological implications. Annu Rev Immunol. 1998;16:293-322.
[3] Mamdooh A Gari. The Role of Janus Kinase 2 (JAK2) in the Pathologenesis of Myeloproliferative Disorders. JKAU: Med. Sci. 16(1). 
[4] Xiaoyi Hu, Jing Li, Maorong Fu, Xia Zhao, Wei Wang. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Signal Transduct Target Ther. 2021 Nov 26;6(1):402.