自噬是一种细胞内的重要途径，用于识别，去除和降解自噬小体内的胞内成分，细胞器以及病原体。自从被评为国自然重点以来，自噬的热度一直居高不下。小优回顾了一下之前发的几篇自噬相关的文章，都有较高的阅读量。
LC3：隐秘的自噬标记物！
Nature:自噬促进胰腺癌免疫逃逸的机制
自噬与神经退行性疾病的关系一文带你吃透，不点进来看看？
非编码RNA也是今年的国自然热点，是指一类不参与编码蛋白质的RNA，但具有调节基因表达和蛋白质功能的特性，主要包括microRNA，siRNA，lncRNA，vtRNA等等。在最近几年，非编码RNA文章数也增长迅速。
近十年PubMed非编码RNA相关文献数
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今天小优就从Cell期刊中为大家捞出了一篇关于自噬和非编码RNA的精品高分文章。这篇文章来自德国海德堡的Matthias W. Hentze教授在Cell发表研究：The Small Non-coding Vault RNA1-1 Acts as a Riboregulator of Autophagy，希望能给大家提供更多的思路。
文章概述：
本文表明了vault RNA直接结合自噬受体sequestosome-1/p62。过表达vtRNA1-1抑制p62依赖的自噬。细胞饥饿会降低vtRNA1-1和P62的结合，从而诱导自噬。P62不能结合vtRNA的突变会增加P62的寡聚化，并增加和自噬效应物的关系。因此，vtRNA1-1可以通过集合P62和干扰寡聚化，从而直接调节自噬。
文章亮点：
文章首次发现并研究了P62和RNA的相互作用。该研究首次将自噬相关蛋白P62定性为RNA结合蛋白，并发现vtRNA可通过抑制P62的寡聚化，从而影响细胞自噬。
接下来小优就带大家具体来解析下这篇文章，看看作者的研究思路和实验方法。
1、自噬受体p62/SQSTM1是RNA结合蛋白
故事开始于作者使用了RBDmap技术鉴定RNA结合蛋白中与RNA相互作用的肽段。在结果中发现有一个肽段来自于自噬受体p62/sequestosome-1，表明P62与RNA相互作用。考虑到哺乳动物的自噬受体和RNA的相互作用还没有人研究过，作者决定继续研究。
作者使用WB和Co-IP技术进一步鉴定p62和RNA之间的关系。WB和Co-IP结果均显示p62是一个RNA结合蛋白（Fig.1A and 1B）。然后作者用iCLIP技术确定是哪种RNA和p62结合。结果表明，有四种vault RNA和p62结合紧密。更多分析表明，p62优先结合在vtRNA的中心结构域的环状区域（Fig. 1C,1D and 1E）。
综上，结果显示，p62和vtRNA的中心结构域有相互作用。
Fig.1 自噬受体p62是RNA结合蛋白
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| 货号/推荐 | 名称 | 用途 |
| 88588S | SQSTM1/p62(D5L7G) Mouse mAb | 抗体 |
| 3449 | TDP43(A260) Antibody | 抗体 |
| 10600023 | PVDF 0.45UM 300MMx4M 1/PK | PVDF转印膜 |
| 10600002 | PT 0.45UM 300MMx4M 1/PK | NC转印膜 |
| abs955-50tests | 免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒 | Co-IP试剂盒 |
| 17127901 | RPROTEIN A SEPHAROSE FF | ProteinA琼脂糖 |
| 17061801 | PROTEIN G SEPHAROSE 4 FF | ProteinG琼脂糖 |
| SH20022 | DMEM高糖培养基 | 培养基 |
| SH30809.01 | RPMI 1640培养基 | 培养基 |
| SH30406.05 | 新西兰胎牛血清 | 血清 |
2、Vault RNA 1-1是P62主要结合的RNA
作者进一步验证vtRNA和p62的相互作用。作者使用了p62 RIP-qPCR技术进行验证。作者发现vtRNA1-1是p62主要结合的RNA（Fig. 2A）。作者在多个细胞系进行验证（Fig. 2B and 2C）。
接着作者用纯化的蛋白和放射性标记的RNA进行EMSA实验。作者在构建p62的质粒的时候在N端加上了MBP标签，然后用MBP的填料进行纯化。结果表明MBP-62和vtRNA1-1形成复合物。
为了验证MBP-p62和vtRNA1-1的相互作用是否是特异性的，作者使用非标记的tRNA作为特异性的竞争者，IRE或者细菌tRNA作为非特异性的竞争进行实验。结果表明，非标记的tRNA可以有效的和标记的vtRNA竞争，而IRE或者细菌tRNA不能竞争（Fig.2D）。
综上，p62在体外可以特异性的结合vtRNA1-1。
Fig.2 P62结合Vault RNA1-1
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| 货号 | 名称 | 用途 |
| abs60093-100次 | Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit | qRT-PCR试剂盒 |
| 28918780 | MBPTrap | 蛋白纯化柱 |
| 28935597 | Dextrin Sepharose High Performance | 蛋白纯化填料 |
| 29148721 | Superdex 75 Increase 10/300 | 蛋白纯化柱 |
| 28990944 | Superdex 200 increase 10/300 | 蛋白纯化柱 |
3、vtRNA1-1抑制p62介导的自噬
接下来作者想要继续研究vtRNA1-1和p62相互作用的意义。首先作者验证p62会不会介导vtRNA的溶酶体降解。结果表明，无论是在p62干扰或者敲除的细胞中，vtRNA的表达水平都没有影响（Fig 2F and 2G）。
接下来作者进行反向研究，看看vtRNA1-1会不会影响p62在自噬中的功能。作者在细胞中敲低 vtRNA1-1，监测自噬流通过检测两个参数，LC3B-1到LC3B-II在自噬体组装中的转换，以及p62的水平反映自噬溶酶体降解。结果表明，vtRNA1-1敲低会刺激LC3B的转换（Fig. 3A and 3B），表明自噬流的增加。为了验证这个现象是否依赖于p62，作者同时去除了p62和vtRNA1-1。作者发现，去除P62会部分减缓LC3B的转换速率在vtRNA1-1敲除之后（Fig. 3C）。免疫荧光实验也显示，vtRNA1-1的去除表现为LC3B数量增加（Fig. 3D and 3E）。
作者也检测了vtRNA1-1表达增加会发生什么。检测发现，vtRNA1-1表达增加会抑制LC3B的转换，并且会引起p62的积累（Fig. 3G），表明自噬流的下降。相对的，其他vtRNA的过表达不会影响LC3B的转换速率。
综上，vtRNA1-1表达上调和下调都会影响p62依赖的自噬。
Fig.3 vtRNA调节P62依赖的自噬
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| 货号 | 名称 | 用途 |
| 101000046 | jetPRIME | 转染试剂 |
| 2775S | LC3B Antibody | 抗体 |
| 4408S | Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 488 Conjugate) | 荧光抗体 |
| 4413S | Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 555 Conjugate) | 荧光抗体 |
4、p62结合vtRNA1-1主要通过锌指结构域
为了研究vtRNA1-1抑制p62功能的机制，作者决定构建一些p62的突变体。P62有多个结构域，每个结构域都有对应的功能，但是没有传统的RNA结合的区域（Fig. 5A）。为了鉴定p62的RNA结合区域，作者使用RBDmap数据并且检查了在ZZ结构域中RBDpep附近的区域（Fig. 5A and 5B）。作者从HuH-7细胞中敲低内源的p62，然后将一些p62变体转染到细胞中。结果表明，p62 K141A变体展现了很强的降低RNA结合的作用(Fig. 5C)。
接着，作者用P62 KO细胞进行验证。作者使用CRISPR/Cas9技术构建了HuH-7 P62 KO的细胞株。然后转染一个三突变体，R21A，D69A和D73A。p62 PB1m也同样会降低RNA的结合（Fig. 5D）。
综上，p62主要通过锌指结构域结合vtRNA1-1。
Fig. 5 P62结合vtRNA1-1主要通过锌指结构域
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5、vtRNA调节p62和Atg8蛋白家族的相互作用
作者进一步对下游机制进行研究。首先作者验证是否RNA的结合会影响p62和Atg8蛋白家族的LC3B和GABARAP的相互作用。通过Co-IP实验，作者发现敲低vtRNA1-1，P62和LC3B的相互作用降低（Fig. 6A）。同样的现象也表现在vtRNA1-1 KO的HuH-7细胞中(Fig. 6B)。
作者进一步使用p62 KO的HuH-7细胞转染p62 WT，PK/A和PB1m质粒。结果表明，p62 RK/A表现出和GABARAB更强的相互作用（Fig. 6C and 6D）。而p62 PB1m展现出对LC3，GABARAP和NBR1较低的结合（Fig. 6C and 6D）。
综上，去除vault RNA1-1或者使P62 RNA结合缺失都会增加P62和LC3B和GABARAP的结合，这些数据表明vault RNA1-1的结合影响P62和Atg8蛋白家族的相互作用。
Fig. 6 vtRNA1-1影响P62和Atg8蛋白家族的相互作用
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| 货号 | 名称 | 用途 |
| 13733S | GABARAP(E1J4E) Rabbit mAb | 抗体 |
| abs153912-50ul | Rabbit anti-NBR1 Polyclonal Antibody | 抗体 |
总结
在这篇文章里，作者使用了多种方法研究vtRNA和P62的相互作用以及对自噬的影响，例如Co-IP，iCLP，RIP-qPCR，EMSA，CRISPR/Cas9，蛋白纯化等等。具体的实验方法在文献中都有详细介绍。今天想为大家重点介绍一下蛋白纯化的方法。
为了更加方便的改造蛋白或者更加便宜和便捷的大量得到某种目标蛋白，现在越来越多的实验室都在选择蛋白纯化的方法进行蛋白的纯化和改造。蛋白纯化的步骤主要分为：质粒构建——蛋白表达——蛋白纯化，可以选择使用原核或者真核生物作为表达体系。具体的操作方法和视频，大家可以点击查看原核标签蛋白纯化解决方案，里面有详细的操作步骤和视频提供给大家，千万不要错过哦！
像文章中纯化P62时加上的MBP和His标签也是蛋白纯化常用的标签。首先作者构建了MBP-p62-his质粒，然后在 E.coli BL21(DE3)大肠杆菌表达体系中进行表达。在37℃培养了6小时之后，细胞恢复到室温，然后在20℃继续培养16H。细胞加入裂解液 (50mM HEPES pH 8.0, 1M NaCl, 0.5 mM TCEP, 1x protease inhibitor)，并且使用超声进行裂解。然后用His标签预装柱和MBP标签预装柱进行纯化。
常见的纯化标签及区别
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