泛素化在癌症研究中的研究思路，5篇文章带你来了解

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蛋白质泛素化是一种动态的、多方面的翻译后修饰，几乎涉及真核生物生物学的所有方面。泛素一旦连接到底物上，就会对底物进行进一步的修饰，产生大量不同的信号，产生不同的细胞结果，称为“泛素密码”。在E1、E2和E3泛素连接酶的作用下，泛素的七个赖氨酸(Lys)残基或n端的甲硫氨酸可与底物形成共价键，进而形成包含复杂拓扑结构的泛素链。另外，泛素Lys残基可以被泛素类分子(如SUMO或NEDD8)修饰。最后，泛素的赖氨酸还可以被乙酰化，或在Ser、Thr或Tyr残基上磷酸化，每一种修饰都有可能显著改变信号转导结果。

代谢重编程，包括大分子生物合成的增强，能量代谢的改变，氧化还原稳态的维持，被认为是癌症的一个标志，维持癌细胞的生长。多种信号通路、转录因子和代谢酶参与了癌症代谢的调节，因此，代谢重编程是一个高度复杂的过程。作为翻译后修饰最重要的类型之一，泛素化和去泛素化在癌细胞代谢重编程中的调控作用意义重大，泛素化和去泛素化的失调会导致各种疾病，包括癌症。

之前，小优也给大家分享过两篇泛素化相关的内容，一篇是整理了2019年的部分高分文章的科研思路，另一篇是通过两份高分文章阐述了泛素化参与细胞凋亡、细胞自噬、细胞代谢等生理过程。在这里，小优博士又细读了五篇近期发表的关于泛素化修饰的高分文章，分别从研究背景、研究思路及主要结论整理分享给到大家，希望对大家的科学研究起到帮助。

PART.1

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研究背景

FBXW2是69个F-box蛋白之一，在SCF (SKP1-Cullin1-F-box蛋白) 泛素连接酶复合物中作为底物识别受体。FBXW2通过靶向SKP2降解抑制肺癌细胞增殖但其是如何参与调节肿瘤的侵袭和转移的过程的，目前尚不清楚。

在这篇文章里，报道了FBXW2是β-连环蛋白的E3连接酶。FBXW2通过EGF-AKT1介导β-catenin的Ser552磷酸化与之结合，并促进其泛素化和降解。功能上，FBXW2过表达通过阻断β-catenin驱动的mmp的转激活抑制迁移和侵袭，而FXBW2敲低则促进了体外和体内肺癌细胞的迁移、侵袭和转移。

研究思路

❖FBXW2与底物β-catenin结合位点的检测及验证。

❖FBXW2对底物β-catenin的泛素化及蛋白水平的影响。

❖AKT1介导β-catenin的Ser552磷酸化已有报道，但是否参与FBXW2介导的β-catenin的降解需要进一步验证。

❖FBXW2在表型上对肺癌的作用。

主要结论

01 FBXW2通过底物一致的 TS MGG T 基序与β-catenin结合。

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02 FBXW2泛素化β-catein，缩短其半衰期。

下调FBXW2基因的表达，β-catein及552位丝氨酸被磷酸化的β-cateins552蛋白降解时间均延长。

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03 AKT1是FBXW2介导的β-catenin降解所必需的。

已有报道AKT1被EGF激活，使β-catenin的Ser552位点磷酸化，促进其在细胞核中的积累。通过将AKT1基因下调，FBXW2介导的β-catenin蛋白的降解相较于对照组时间延长。

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04 FBXW2抑制体外和体内癌细胞的迁移和侵袭。

将FBXW2表达下调时，肺组织出现了明显的结节，当β-catenin基因挽救了肺转移结节数量消失或明显减少了。

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05 FBXW2和β-catenin水平患者生存曲线预测：

当FBXW2表达较高而β-catenin较低时，患者生存期较长，反之较短。

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06 β-cateninS552分别受FBXW2和β-TrCP调节的信号通路分析

Wnt-β-TrCP-β-cateninS552信号通路主要参与肿瘤细胞增殖的调控过程，而FBXW2-β-cateninS552信号通路主要参与肿瘤细胞的迁移和侵袭的调控过程。

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PART.2

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doi:10.1038/s41418-021-00862-4

研究背景

转录因子核因子- kb (NF-κB)在多种癌症中发挥重要作用。它由五个成员组成，p65 (RELA)， p50 (RELB)， c-REL, NF-κB1和NF-κB2。NF-κB主要作为致癌基因，在肿瘤中起着非常复杂的作用。NF-κB最丰富的形式是p50和p65亚基的异源二聚体。p65亚基具有转录激活区域，参与细胞生存、侵袭、增殖、转移、血管生成和化疗耐药性。p65的泛素化在调节其功能方面起着重要作用。

本研究发现p65是FBXW2的一种新的底物，FBXW2直接与p65结合，导致其泛素化和降解，这为FBXW2在乳腺癌中的抑癌功能提供了新的见解。

研究思路

❖为了研究FBXW2在乳腺癌中的功能，使用以FBXW2为诱饵，通过质谱分析在MCF-7细胞中识别相互作用蛋白。

❖FBXW2作为泛素连接酶验证其对底物的表达水平的影响。

❖FBXW2对底物p65的泛素化作用。

❖在遗传学上，研究FBXW2对底物p65的调节作用在癌症中的表现

主要结论

01 p65是FBXW2的一个新的底物。

通过IP, pull down和共定位实验验证了p65与FBXW2的互作功能。

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02 FBXW2通过泛素-蛋白酶体途径促进p65的降解。

经WB实验，在293T细胞中过表达FBXW2，随FBXW2浓度的增加，p65表达量降低；但当过表达FBXW2失活蛋白后，p65表达量较对照组增加（A, B）。同样在MCF-7和MB231细胞中，过表达FBXW2，p65表达量降低相较于对照组降低（C, E）；下调MCF-7和MB231细胞中FBXW2的表达，p65表达量相对升高（D, F）。

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03 FBXW2在K122位点泛素化p65依赖于p300诱导的乙酰化。

质谱显示p65的K122位点被泛素化或乙酰化。相关报道p65在K122位点被p300乙酰化，因此作者通过实验阐明了泛素化与p65乙酰化之间的关系。

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04 p65参与FBXW2抑制乳腺肿瘤生长

下调FBXW2表达，发现异种移植的肿瘤不论在体积还是重量方面相较于对照组都显著增加。

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05 在乳腺癌组织中FBXW2表达与p65呈负相关

为了评估FBXW2和p65在乳腺癌组织中的表达，作者对乳腺癌组织进行了免疫组化分析。发现与之前的观察一致，FBXW2在乳腺癌组织中低表达，而p65在乳腺癌组织中高表达，FBXW2与p65蛋白水平呈负相关（A，B）。为了确定FBXW2的表达是否与患者生存相关，进行了Kaplan-Meier生存分析，在1764个乳腺癌样本中，发现FBXW2高表达预示着更好的患者生存（C）。所有这些数据都支持靶向FBXW2-p65轴作为乳腺癌治疗的临床潜力。

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PART.3

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研究背景

类泛素化被发现调节各种代谢过程，包括脂肪生成、脂肪酸β-氧化、核苷酸代谢和细胞氧化还原状态等等。异常的类泛素化激活在人类癌症中经常被观察到，类泛素化抑制被提出作为癌症的一种治疗方法。类泛素化修饰是一种翻译后修饰，它将泛素样肽NEDD8附着在底物蛋白的赖氨酸残基上，以调节其活性或功能。类泛素化是由E1 NEDD8激活酶 (NAE)， E2 NEDD8共轭酶和E3类泛素化连接酶催化的。MLN4924，是NAE的第一类小分子抑制剂，目前作为单一药物或与化疗药物联合处于多个阶段I/II临床试验。

Speckle-type POZ protein (SPOP)是一种底物适配器基于Cullin 3的E3连接酶(CRL3). SPOP在肿瘤发生中的作用与肿瘤类型有关，但它主要作为一种肿瘤抑制剂。机制研究表明，SPOP靶向底物进行泛素化依赖降解或非降解泛素化，以调节许多细胞事件。如CRL3SPOP是否以及如何调节谷氨酰胺代谢是完全未知的。

研究思路

❖MLN4924抑制ASCT2后对谷氨酰胺的影响。

❖筛选对ASCT2起泛素化作用的蛋白及作用机制。

❖有相关报道底物的磷酸化对SPOP结合底物至关重要，因此筛选对ASCT2起磷酸化作用的酶非常重要。

❖观察SPOP-ASCT2在遗传学方面对癌症的影响。

主要结论

01 MLN4924通过ASCT2促进谷氨酰胺吸收和代谢。

首先在代谢表型方面：通过MLN4924（NEDD8活化酶NAE小分子抑制剂）处理后，ASCT2累计量大幅增加，促进了谷氨酰胺的吸收及代谢。

02 SPOP通过促进ASCT2泛素化负向调节其稳定性。

结合以前的研究资料及体外活性实验鉴定证明SPOP促进ASCT2的泛素化，SPOP下调后， ASCT2的表达量相对于对照组显著增加。

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03 CK1δ(not α or ε)是SPOP介导的ASCT2降解所必需的。

有相关报道底物的磷酸化对SPOP结合底物至关重要，通过计算机辅助算法找到CK1家族蛋白并确定CK1δ (not α or ε)是SPOP介导的ASCT2降解所必需的，通过氨基酸定点突变 验证了ASCT2有三个位点的丝氨酸是磷酸化靶点。

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04 SPOP-ASCT2 axis调节乳腺癌细胞生长和存活。

在遗传学方面，经异种移植，在SPOP蛋白下调后，肿瘤在体积和重量方面都显著增加。

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PART.4

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研究背景

之前的研究报道了Hippo通路下游核心效应子yes-associated protein (YAP)促进胶质母细胞瘤(GBM)的恶性进展。然而，尽管YAP的经典调控机制已经得到了很好的探索，但对YAP是如何通过与Hippo无关的方式被调节的机制仍知之甚少。同时，在GBM中低表达并具有肿瘤抑制作用的nonreceptor tyrosine kinase Fyn-related kinase (FRK)被报道参与了蛋白磷酸化的调节。在这里，研究了FRK是否可以通过调节YAP活性来抑制肿瘤的进展。

研究思路

❖首先检测肿瘤中FRK与 YAP之间的关系。

❖FRK作为一种激酶，对底物的磷酸化的作用检测。

❖筛选到对YAP进行泛素化作用的E3连接酶及其作用机制。

❖在遗传学表型验证方面验证FRK对胶质瘤的作用。

❖文章的总结工作。

主要结论

01 胶质瘤样品中FRK的表达水平与YAP的表达水平呈负相关。

在遗传学表型方面：在不同程度的胶质瘤样本中，FRK表达量异常减少，而YAP异常增加，两者成负相关关系。

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02 FRK促进YAP的Tyr391/407/444磷酸化从而促进其通过Siah1进行泛素化和降解。

FRK作为一种激酶，对底物的磷酸化具有重要作用，通过对YAP的Tyr391/407/444进行定点突变后，发现其无法被FRK进行IP，并降低了泛素化水平。

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03 筛选到对YAP进行泛素化作用的E3连接酶。

接下来，通过质谱方法筛选到对YAP进行泛素化作用的E3连接酶为Siah1, 下调Siah1的表达，YAP表达量增加，但经MG132（蛋白酶体抑制剂）处理后， YAP的泛素化水平相对于对照降低了，证明Siah1蛋白通过YAP泛素化介导其经26S蛋白酶体降解。

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04 FRK抑制胶质瘤的进程，而过表达YAP会使这一抑制状况解除。

在遗传学表型验证方面，FRK的过表达，会抑制胶质瘤的进程，并促进生存期的延长。

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05总结：

在生理条件下，FRK将YAP的Y391/407/444位点磷酸化，促进YAP与Siah1泛素连接酶的结合，导致YAP蛋白在细胞质和细胞核中降解，进而抑制GBM的进展。而FRK在GBM中的表达减少，导致相反的效果。

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PART.5

E3 ligase RNF167 and deubiquitinate STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression

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doi.org/10.1016/j.molcel.2022.01.002

研究背景

mTOR复合体1 (mTORC1)是一个重要的代谢中枢，协调细胞代谢与营养的可用性，包括氨基酸。Sestrin2被鉴定为胞质亮氨酸传感器，可将亮氨酸状态信号传递到mTORC1。

在本研究中，我们发现E3泛素连接酶RING finger蛋白167 (RNF167)和去泛素酶STAMBPL1共同控制Sestrin2的多泛素化水平，以响应亮氨酸的可用性。

研究思路

❖在氨基酸耗损的情况下，mTORC1通路组分的转录后修饰情况检测。

❖泛素化是一种受E3泛素连接酶和DUBs紧密调控的动态修饰。为了作为氨基酸可用性的动态编码，Sestrin2的泛素链必须在氨基酸补充时被DUB去除。因此，筛选Sestrin2泛素链的去泛素化酶为下一步工作。

❖Sestrin2是一种亮氨酸受体，直接感知亮氨酸的可用性，调节mTORC1活性，检测亮氨酸对SESTRIN2的泛素化修饰的影响非常重要。

❖遗传学表型研究。

❖信号通路总结模式图。

主要结论

01 RNF167催化Sestrin2的泛素化，抑制氨基酸耗损的mTORC1信号。

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02 STAMBPL1通过氨基酸充分性使Sestrin2去泛素化，激活mTORC1信号。

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03 Sestrin2的亮氨酸结合状态决定了k63连接泛素化的程度。

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04 STAMBPL1的缺失抑制了异种移植肿瘤的生长。

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05 Highlights：

· RNF167和STAMBPL1调节Sestrin2泛素化以响应亮氨酸状态

· 泛素化的Sestrin2通过隔离GATOR2抑制mTORC1的活性

· 抑制STAMBPL1功能可抑制肿瘤生长

· STAMBPL1是结直肠癌潜在的治疗靶点

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