两篇文章带你解析肿瘤免疫微环境相关研究思路

在肿瘤发生发展过程中，包括但不限于巨噬细胞、DC（dendritic cell）、中性粒细胞、B细胞、T细胞、CAF（tumor associated fibroblast）等多种细胞被招募到肿瘤细胞周围的微环境中，与ECM（extracellular matrix）等元素共同构成肿瘤免疫微环境TIME（tumor immune microenvironment）。

 

在TIME中的多种成分，包括T细胞、B细胞以及分泌的相关因子等虽然对肿瘤起着免疫作用，但还有许多其它成分，如细胞方面包括M2型巨噬细胞、Treg细胞、Th2细胞及MDSC （Myeloid‑derived suppressor cell）等发挥着免疫抑制的作用，细胞因子方面IL-4、IL-5、IL-10、TGFβ、MMP9和VEGF等等也通过特定的机制起着促进免疫逃逸和肿瘤发生发展的作用。在免疫的过程中，肿瘤细胞也衍生出了各种对抗免疫的机制，例减少抗原的表达，抑制DC细胞的抗原递呈能力，抑制细胞毒性T细胞的浸润等等。

 

在过去的十年里，虽然关于TIME的研究文章呈逐年递增的状态，TIME方向作为国自然研究的热点，提供了大量的基金支持，但鉴于TIME的复杂性以及癌症治疗的困难性、高复发率，对TIME的研究仍任重道远。在这里，小优博士又整理了两篇近期发表的关于TIME的高分文章，分别从研究背景、主要研究结果方面分享给大家，并对相关的研究思路做了部分总结，希望对大家的科学研究起到帮助作用。

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研究背景  

骨肉瘤是最常见的骨肿瘤之一，主要发生在青少年。尽管在手术和化疗方面取得了很大的成就，但骨肉瘤患者的预后仍不理想。复发性骨肉瘤是临床的一大挑战，复发性骨肉瘤患者预后较差。因此，迫切需要深入探讨骨肉瘤的进展机制，加强对复发性骨肉瘤的认识。

 

肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)主要由多种细胞类型和细胞外基质组成，与癌细胞相互作用，促进癌症进展。癌症相关成纤维细胞(CAFs)是TME中最常见的细胞，可通过癌症干细胞更新、免疫治疗疗效减弱和化疗耐药性导致癌症进展。然而，CAFs免疫抑制特征在OS中的作用和机制值得进一步研究。

 

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种强大的新工具，可以检测遗传和功能异质性，重建细胞成分及其相互作用，并检测罕见的TME亚群。ScRNA-seq用于识别和分析OS的精确细胞簇和组成。然而，这些研究都集中在细胞成分上，并没有明确阐明TME在OS进展中的作用和机制。

 

本研究在前期研究GSE152048和GSE162454的基础上，利用scRNA-seq和生物信息学技术揭示CAFs在复发性OS TME中的调控作用。这可能在单细胞水平上促进对CAFs在复发性骨肉瘤TME中的作用和机制的理解，为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。

 

首先，为了便于大家理解本文的研究思路，作者精心制作了一个研究流程图，如下：根据GSE152048(BC)和GSE162454(OS)的数据集，作者进行了scRNA-seq分析，以研究原发性、复发性和肺转移性骨肉瘤病变的细胞构成。GSE152048(BC)包括来自7个原发、2个复发和2个肺转移性OS病变的100987个细胞。GSE162454 (OS)包括29278个细胞，这些细胞来自6个原发性OS患者在接受新辅助化疗之前。此外，作者又使用三个配对的原发性和复发性OS样本，通过免疫荧光、预后分析等方法来验证scRNA-seq的结果。

文章研究路线图

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主要结果部分 

01复发性OS中，CAFs的浸润水平较高

经过数据分析发现，原发性、复发性和肺转移性OS病灶中鉴定出14种细胞类型(A)，且三种OS病灶的t-SNE图叠加，发现复发性OS病变的Div-CAFs(diverse CAF)较突出(B)。虽然细胞种类在三种类型的OS病灶中没有大的差异，但部分比例变化非常大，尤其是肿瘤相关成纤维细胞CAF，原发性与复发性的比例为3.58%和96.42% (C)，说明了复发性OS中，CAFs的浸润水平比较高。

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02在复发性OS患者组织中，CAFs与EMT相关

对原发性和复发性OS病灶中对差异表达的HALLMARK基因进行通路富集分析，发现EMT（上皮间充质转化）通路相关基因在复发性OS组织中明显激活。

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03遗传学方面证明CAFs在复发性OS中具有较高的浸润性

（a） WB检测发现与OS细胞相比，CAFs具有较高的N-cadherin ( EMT 的marker )表达和较低的E-cadherin表达。同样在复发性OS中，由于CAFs的浸润较多，N-cadherin表达也较高(A)。

（b） CAFs激活marker：(a-SMA：recombinant stromal cell derived factor 1，FAP: fibroblast activation protein) a-SMA和FAP在复发性OS组织中显著升高(B)。

（c） 通过TIMER数据库分析，FAP与EMT 的marker E-cadherin显著负相关，而与N-cadherin显著正相关(C)。

（d） IF实验补充表明复发性OS组织中的a-SMA表达高于原发骨肉瘤组织，E-cadherin表达较低(D)。

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04CAFs表达的LOX的表达模式及临床意义

LOX: lysyl oxidase,赖氨酸氧化酶，是细胞外基质中分泌的一种酶，底物是胶原蛋白和弹性蛋白（骨和肺的主要成分），这也是为什么骨肉瘤容易向肺部转移的一个主要原因。

 

通过对CAFs和Div-CAFs细胞中差异表达的基因数据分析(A, B)及IHC实验(C, D)验证表明LOX在复发性OS组织中较原发性高，预后分析也表明LOX的高表达导致明显的预后较差(E)。

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05在体外LOX 促进复发性OS

接下来，作者用LOX的抑制剂BAPN (β-氨基丙腈是一种特异性的不可逆LOX抑制剂，作用于LOX或LOXL同工酶的活性位点)进行处理，发现：CAF细胞降低，OS及TAM细胞无明显变化（A）；CAF的基质激活marker a-SMA和FAP表达量降低（B）；N-cadherin ( EMT 通路的marker )表达降低（C, D）；OS 细胞的迁移率及伤口愈合速率均明显降低篇（E）；另外检测到起促进免疫反应的M1类型的巨噬细胞（INOS）明显升高而抑制免疫反应的M2型巨噬细胞（CD163）降低（F）。

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06在体内，LOX抑制产生抗OS作用

接下来在体内验证LOX的作用，对肿瘤进行异种移植，经BAPN处理后，检测到肿瘤体积降低， LOX表达水平降低（A，B）；CAF的基质激活marker a-SMA和FAP表达量也降低（C）；同样的与体外检测结果一致，M1类型的巨噬细胞明显升高而M2型巨噬细胞降低（D）；最后，CD8细胞有所升高但不明显（E）。

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最后，作者制作了一张示意图，对本文的研究做出总结。即在复发性骨肉瘤中，CAFs浸润水平较高，在复发性OS的细胞类型中，LOX在CAFs中表达量最高，BAPN抑制LOX可调节CAFs功能，诱导巨噬细胞向促进免疫的M1类型极化，进而抑制OS。

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Doi:10.1136/jitc-2020-002115

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研究背景  

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性疾病，治疗选择有限。TNBC患者通常采用新辅助或辅助化疗。TNBC患者对化疗反应的生存期改善与肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的存在有关。因此，肿瘤免疫微环境(TIME)中TILs (特别是CD8+T细胞)的增加可以预测早期TNBC患者对治疗的反应和预后的改善。

 

MUC1-C是一种在TNBC细胞中异常表达的致癌蛋白。MUC1-C通过诱导上皮细胞-间充质转化(EMT)、表观遗传重编程、干性、自我更新能力来驱动TNBC细胞进展中的谱系可塑性。EMT和癌症干细胞状态与免疫逃避有关，尽管机制尚不清楚。

 

本文对大量和单个TNBC细胞RNA-seq数据集的分析进一步表明，MUC1与JAK1、STAT1、IRF1、IDO1和PTGES的内在表达有关。在TNBC的肿瘤免疫微环境中，MUC1与CD8+ T细胞的衰竭和功能障碍有关。这些发现为MUC1-C在TNBC中整合谱系可塑性和免疫抑制提供了新的见解。

 

主要结果部分

01MUC1-C激活IFN-γ→JAK1→STAT1信号通路富集的整个转录程序

对BT-549 TNBC细胞的整体转录谱分析表明，诱导MUC1-C沉默可导致基因表达的广泛变化，约有2300个基因的表达产生了下调，1100多个基因的表达有所上调（A）。进一步分析发现沉默MUC1-C会导致(1)STAT1和IRF1（B）以及(2) IFN通路反应基因的下调（C），与MUC1-C诱导的表达模式相关的主要调控因子包括STAT1和IRF1，证实MUC1-C通过STAT-IRF转录因子活性介导信号传导(D)。Motif评估进一步验证了MUC1-C诱导的差异表达基因在STAT和IRF Motif中高度富集(E)。总之，这些发现表明STAT-IRF因子是MUC1-C诱导的TNBC细胞转录应答的主要驱动因素。

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02在TNBC细胞中MUC1-C激活JAK1→STAT1→IRF1信号

接下来，在BT-549和SUM149细胞中降低MUC1-C基因的表达，发现STAT1和IRF1基因在mRNA及蛋白水平的表达均有所降低（A-C）。通过对MUC1-C基因的蛋白序列分析，发现MUC1-C包含分别结合JAK1和IRF1的两个motif，JAK1作为激酶，当MUC1-C结合两种蛋白时，便会对STAT1进行磷酸化，因此在前面的实验结果中，由于MUC1-C基因的下调，磷酸化的pSTAT1蛋白也降低（A-C）。接下来，通过用MUC1-C的抑制剂GO-203抑制MUC1-C的表达，同样检测到了JAK1，STAT1，pSTAT1, 及IRF1蛋白表达的下调，再次验证了之前的结果。

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03下调MUC1-C 抑制IRF1下游基因 IDO1 和 COX2/PTGES

MUC1-C下调后，作者又对下游基因IDO1在BT-549及COX2/PTGES的表达情况进行了检测。检测到在BT-549、SUM149细胞中及抑制剂GO-203处理后，IDO1表达水平均降低（B-D）。 此外，作者发现MUC1-C驱动COX2/PTGS2和PTGES (E)的表达，它们共同合成PGE2 (一种与TNBC肿瘤生存率降低相关的T-cell功能抑制剂)。为了支持这些结果，对MDA-MB-468 TNBC细胞的研究证实MUC1-C驱动COX2和PTGES的表达(F-G)。

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04MUC1 与免疫细胞浸润的减少有关

接下来，为了检测MUC1-C对免疫细胞浸润的影响，作者对两种RNA-seq数据TCGA-BRCA cohort（A）及METABRIC cohort (B)进行了分析，结果显示，相对于MUC1-C表达低的肿瘤，MUC1-C表达高的肿瘤中的免疫细胞浸润明显减少，特别是CD8+ T细胞、CD8+naive T细胞、B细胞和Th2细胞等（C, D）。在MUC1-C表达低和MUC1-C表达高的情况下，细胞类型富集的总体模式在TCGA-BRCA和METABRIC队列中显著相关（E, F）。此外，在两个数据中，基于所有免疫细胞类型估计的总免疫活性的定量在MUC1-C表达高的情况下显著降低（G）。

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05MUC1-C在TNBC肿瘤中的表达与IFN-γ通路的激活和CD8+T细胞的衰竭和功能紊乱有关

结合实验结果及通过对TNBC肿瘤中TCGA-BRCA和METABRIC数据分析，发现MUC1与IFN-γ通路的激活有关（A, B）；MUC1-C的表达与CD8+ naive T细胞的耗竭显著相关（C, D）；IFN-γ通路在t细胞功能紊乱的TNBCs中高度富集（E, F）；此外还发现MUC1-C在两种TNBC数据集中都与T-cell功能障碍显著相关，这表明MUC1-C诱导的IFN-γ通路激活导致CD8+ T细胞排斥和功能障碍。

 

最后，对本文的研究做出总结，MUC1-C通过诱导IDO1和COX2激活IFN-γ→STAT1→IRF1通路（I），这为MUC1-C在TNBC的肿瘤免疫微环境中驱动CD8+ T细胞排斥和/或功能紊乱的潜在重要性提供了支持。

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总结，在看了一些关于肿瘤免疫微环境相关的文章后，对于一些研究思路，小优博士做了一些总结，并形成了一个流程图，当然不能代表所有相关的思路，希望为各位小伙伴的研究带来一些参考作用。

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