罗工专题之理论(四)

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• 1、荧光补偿从哪里来？
• 2、血液采集管的选择比你想象的重要哦！
• 3、人和小鼠的NK细胞研究指标怎么选？
• 4、小鼠ILC细胞亚群检测指标怎么选？
• 5、快速了解肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）
• 6、血清和血浆样本的区别、制备和保存

 

 

1、荧光补偿从哪里来？（点击返回目录）

大家在进行流式多色数据分析中，大家总是闻“补偿”色变。那么对于新手小白来说，补偿到底是什么东东呢？它又是如何产生的呢？

说到补偿，我们需要先带大家快速回顾下荧光素的特性和仪器的检测原理，每个荧光素的发光和检测情况，是由激发光谱和发射光谱2个性质共同决定的，详情请看如下回顾:

【罗工流式秘籍56】如何确定一些陌生荧光素，在流式细胞仪上是否可用？

那目前市面上的荧光素是有非常多的种类的，而流式仪可以接收发射光谱检测范围仅400+nm，要容纳如此多种的荧光素波长还是略显拥挤。

传统流式仪检测的只是荧光素发射光谱中最亮的一个区段，而不同荧光素的光谱之间其实是会有部分重叠的，这部分重叠的光谱信号就是补偿产生的主要来源，在我们的流式实验中又被叫做荧光溢漏。

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荧光素补偿产生的原因有以下3种情况：

1、荧光素在发射光谱上相邻

比如最经典的，大家最耳熟能详的FTIC和PE荧光素，就是因为在发射光谱上是非常相近的，FITC的发射光谱区段过长，很多荧光信号进入了PE荧光素的检测范围。

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2、单体荧光素和对应荧光的复合/串联荧光素

同样还是大家非常熟悉的PE荧光素和PE-Cy7荧光素也会存在补偿。通俗地来讲就是两种荧光素的名称部分一致，就一定会存在补偿，再例如APC和APC-CY7，看起来就是“师出同门”，一个为单体染料，一个是复合染料，那么相应地就会产生补偿值。

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3、发射波长相近的

那为什么很多不同激光激发的荧光素之间也有干扰呢，这是因为很多荧光素的激发波谱范围很宽，再非最佳的激光激发下也会有部分能量吸收进而产生发射光，从而对不同激光的发射波长相近的荧光素产生了干扰，不过相对来说干扰一般不会特别大。

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我们平时在进行较少指标的检测时，推进大家可以尽量“错开”以上介绍的原理相关的荧光通道的同时使用，以减少荧光素之间的互相干扰，省去调补偿的麻烦，还可以达到最优的实验结果。

那如果是多色流式实验，指标非常多，荧光素通道实在没有办法避开补偿怎么办呢？

可以直接联系我们优宁维的流式团队获取免费的流式配色方案，我们流式团队有丰富的配色经验，配色时会尽量选择一些与其他通道补偿较小，荧光较亮的荧光素进行搭配，比如BD品牌专利Sirigen系列（简称BV系列）的新型专利荧光染料，够亮，够稳定，补偿够小，用过的人都说好！ 

 

 

2、血液采集管的选择比你想象的重要哦！（点击返回目录）

采血管

外周血是我们流式检测中最常见的样本类型，那我们平时见到的采血管也是五颜六色的，你真的分得清吗？

各个颜色的采血管内含的添加剂都是不同的，自然作用也是不一样的哦！

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我们需要根据想要的血液样本中的成分去选择合适的血液采集管。

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注：肝素抗凝管可以更加优秀的防止溶血，是血浆样本制备的首选

针对流式免疫细胞的相关检测主要推荐如下3种抗凝管：

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3、人和小鼠的NK细胞研究指标怎么选？（点击返回目录）

NK细胞

NK细胞是淋巴细胞中的一员，它无需抗原预先致敏就能破坏靶细胞，且无MHC限制性，应答速度快，在免疫应答的早期即可发挥作用。在一些疾病中NK是免疫细胞的主力军，如肿瘤免疫，感染免疫等。

针对NK细胞的研究，指标该如何选择在于我们的研究目的。本文将介绍一些经典的NK指标，给大家作参考。

 

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一、常用NK鉴定指标

Human：CD3-CD56+CD16 +/-

人的NK细胞在发育的过程中表达出特异性的指标CD56，也有部分NK细胞表达FcγRIIIA（CD16），发育终末还会表达CD57。外周血或其他非纯化NK细胞的样本，检测时还要加上CD3同时检测，以排除一类特殊T细胞——NKT(CD3+CD56+)。

 

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人NK细胞常会分成CD56++ CD16 +/-和CD56dim CD16 ++两个亚群；两者在不同组织器官中占比和功能差异明显。

CD3-CD56dimCD16bri：高细胞毒活性的NK亚群

CD3-CD56briCD16dim：分泌细胞因子的NK亚群

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Mouse:CD3e-CD49b+NK1.1+NKP46+

常规NK检测一般阳性指标CD49b+NK1.1+NKP46+，3者选1就可以判断NK细胞群比例，其中NK1.1在NK细胞发育的最初始阶段就开始表达，相对会检测的更全面一些。

但NK1.1和CD49b选择要根据小鼠的品系：

NK1.1：表达在C57BL, FVB/N, NZB, 但在AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, C57BR, C58, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL, 129中不表达。

CD49b：由于还会表达在胸腺上皮细胞、B细胞、单核细胞等中，在用于NK鉴定时，更推荐抗原克隆位点为DX5的抗体，特异性会更强，基本所有小鼠品系都表达，但在NOD中不表达。

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小鼠NK细胞也可以按发育和功能差异分亚群：

CD11blowCD27low→CD11blowCD27high→CD11brighCD27high→CD11brighCD27low

其中

CD11blowCD27high：未成熟的NK亚群

CD11brighCD27low：高细胞毒活性的NK亚群

CD11brighCD27high：分泌细胞因子的NK亚群

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二、常用NK功能检测指标

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活化水平：CD107a

自然杀伤：脱颗粒途径(Granzyme B, Perforin)。

凋亡诱导配体途径：Fas/FasL、TRAIL/DR4 DR5和TNF/TNFR。

合成和分泌细胞因子：IFN-g，GM-CSF等，活化Mf,诱导Th0®Th1,Ig类别转换;IL-10,TGFβ等导致免疫耐受。

 

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NK细胞表面受体：激活或抑制性受体的表达变化调节NK的免疫功能

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文末总结：

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参考文献：

1. Crinier A, Narni-Mancinelli E, Ugolini S, Vivier E. SnapShot: Natural Killer Cells. Cell. 2020 Mar 19;180(6):1280-1280.e1. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.029. PMID: 32200803.
2. Huntington ND, Cursons J, Rautela J. The cancer-natural killer cell immunity cycle. Nat Rev Cancer. 2020 Aug;20(8):437-454. doi: 10.1038/s41568-020-0272-z. Epub 2020 Jun 24. PMID: 32581320.
3. Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973. doi: 10.1002/eji.201970107.
4. Quatrini L, Della Chiesa M, Sivori S, Mingari MC, Pende D, Moretta L. Human NK cells, their receptors and function. Eur J Immunol. 2021 Jul;51(7):1566-1579. doi: 10.1002/eji.202049028. Epub 2021 May 10. PMID: 33899224.
5. Lorenzo-Herrero S, Sordo-Bahamonde C, Gonzalez S, López-Soto A. 
CD107a Degranulation Assay to Evaluate Immune Cell Antitumor Activity. Methods Mol Biol. 2019;1884:119-130. doi:10.1007/978-1-4939-8885-3_7.
6. Hayakawa Y, Huntington ND, Nutt SL, Smyth MJ. Functional subsets of mouse natural killer cells. Immunol Rev. 2006 Dec;214:47-55. doi: 10.1111/j.1600-065X.2006.00454.x. PMID: 17100875.

 

 

4、小鼠ILC细胞亚群检测指标怎么选？（点击返回目录）

天然淋巴细胞( Innate lymphoid cells，ILC)，是淋巴细胞家族中的一员，是一群在淋巴结发育、 组织损伤修复、宿主抗感染等过程中发挥重要作用的天然免疫细胞。ILC与Ｔ细胞的表型和功能相似，也类似T细胞，有非常多的亚群，可以根据其表达的转录因子和细胞因子等进行分类，发挥各自不同的调节作用，其亚群的比例或功能失调与过敏性疾病、慢性感染、代谢性疾病、肿瘤等多种疾病密切相关。

ILC细胞，主要分为ILC祖细胞（ILCP）、成熟自然杀伤（NK）细胞、ILC1细胞、ILC2细胞、NCR+ ILC3细胞、NCR-ILC3细胞、CCR6+（LTi，淋巴组织诱导）样ILC3细胞、调节性ILC（ILCreg）细胞。

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圈门策略可参考下图：

①门控圈法：

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②圈CD127+lin-的总ILC细胞，并从中首先圈出PLZF+CD218A+的ILCP，其中Lin为阴性指标的合集。

Lin推荐至少包含：B220/CD19排出B细胞干扰；CD3排除 T细胞亚群干扰；CD11b，CD11c排出髓系，NK，DC等细胞干扰；F4/80排出巨噬细胞干扰；Gr-1排除髓系、MDSC等细胞。

其他更完善的添加指标：FcεR1α排出肥大细胞和嗜碱性粒细胞，TCRγδ排除γδT细胞，TER-119 排除红细胞。

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③从ILCP-的群体中再详细圈ILC的各种亚群

各组织都可以采用相同的检测指标，只是不同组织力的亚群占比差异会比较显著（下图上为肺组织，下行为肠道组织）

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④可跟Th细胞的因子检测一样结合PMA/Ionomycin/BFA的细胞因子刺激分泌和阻断外排的混合剂，体外短时刺激5 h左右，或再加其他的一些诱导因子做体外刺激，来检测每种亚群对应的细胞因子的分泌情况

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⑤NK细胞也属于ILC群体中的一员，但由于其会表达多种lin指标中包含的marker，因此圈门跟常规ILC不同，要从Lin+中进行圈门

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⑥ILCreg 主要依靠IL-10来分辨：再死活-CD45+lin-后，靠CD127+IL-10+来进行圈定

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以上，属于ILC非常详细的一个ILC亚群的圈门方法，如果不要求这么细致的话，通常可以进行指标的简化，每种亚群选择1-2个代表性的标志物即可，以下2种文献中的简化圈门方法，当然不止这两种组合方式：

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参考文献：

[1] Spits H, Artis D, Colonna M, et al. Innate lymphoid cells—a proposal for uniform nomenclature[J]. Nature reviews immunology, 2013, 13(2): 145-149.
[2] Mincham Kyle T,Snelgrove Robert J,OMIP-086: Full spectrum flow cytometry for high-dimensional immunophenotyping of mouse innate lymphoid cells.[J] .Cytometry A, 2022, 1-7.
[3] Wang S, Xia P, Chen Y, et al. Regulatory innate lymphoid cells control innate intestinal inflammation[J]. Cell, 2017, 171(1): 201-216. e18.
[4] Amarnath S . Innate Lymphoid Cells Methods and Protocols: Methods and Protocols[J]. Methods in Molecular Biology, 2020.

 

 

5、快速了解肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）（点击返回目录）

肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）

肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中最重要的组成部分之一，是一种具有应力纤维和发达纤维连接的大的梭形间充质细胞，由于其不同的起源会表现出高度的异质性。

当被激活时，CAFs与癌细胞相互作用，表达多种促有丝分裂和促侵袭因子，为肿瘤细胞的增殖生长和侵袭迁移创造了一个有利的环境。趋化因子和细胞因子可以以旁分泌的方式与它们的同源受体结合，从而导致双向或多向通信。

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CAFs的潜在起源：

1. 正常的成纤维细胞可以通过基因突变产生CAFs；癌细胞通过外泌体介导的转化生长因子β（TGFβ）传递和SMAD信号通路将正常成纤维细胞激活为CAFs；

2. CAFs可能通过上皮-间充质转化（EMT）从上皮细胞衍生而来；

3. 间充质细胞是CAFs的潜在来源；

4. 内皮细胞可通过内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）成为CAFs;

5. TGFβ1可以通过激活JAK/STAT3信号通路诱导MSCs分化为CAFs;

6. 其他来源：造血干细胞（HSC）、癌干细胞（CSC）、脂肪细胞、周细胞、平滑肌细胞和星形细胞（相关的证据较少，在不同类型肿瘤中的适用性也有限）

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CAFs的功能及作用机制：

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检测常用标记物：

 

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下图展示了CAFs 的“双面性”。由不同生物标志物确定的 CAFs亚群在肿瘤微环境中发挥着不同的作用。a，表达 α-SMA 或 S100A4 的 CAFs以前被认为是致瘤的，现有研究显示也可能具有抗肿瘤作用。b，大多数生物标志物均为促肿瘤作用。c，CD146+、CAV1high和 PDGFRα+Saa3-已被确定为抑制肿瘤的CAF亚群。

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下表为新发现的一些CAF亚群和生物标志物列表：

 

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参考文献

[1] Biffi G ,  Tuveson D A . Diversity and Biology of Cancer-Associated Fibroblasts[J]. Physiological Reviews, 2020, 101(1).
[2] Ping Q ,  Yan R ,  Cheng X , et al. Cancer-associated fibroblasts: overview, progress, challenges, and directions[J]. Cancer Gene Therapy, 2021.
[3] [1] Chen X ,  Song E . Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 18(2).
[4] Franco O E ,  Shaw A K ,  Strand D W , et al. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2010, 21(1):33-39.
[5] Xing, Fei. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment[J]. Frontiers in Bioscience, 2010.
[6] Sahai, E., Astsaturov, I., Cukierman, E., DeNardo, D.G., Egeblad, M., Evans, R.M., Fearon, D., Greten, F.R., Hingorani, S.R., Hunter, T., et al. (2020). A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat. Rev. Cancer 20, 174–186
[7] Nurmik M ,  Ullmann P ,  Rodriguez F , et al. In search of definitions: Cancer-associated fibroblasts and their markers[J]. International Journal of Cancer, 2019, 146(Supplement 1).
[8] Chencheng Han, Tongyan Liu, Rong Yin. Biomarkers for cancer-associated fibroblasts[J]. Biomarker Research, 2020, 64. 

 

 

6、血清和血浆样本的区别、制备和保存（点击返回目录）

在日常实验中，血液是大家经常会收集的实验样本，除了检测其中的血细胞或免疫细胞。也会检测一些可溶性细胞因子或者免疫球蛋白等等重要成分，需要收集血液中的血清或血浆。

两者究竟有啥区别呢？

   

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血清/血浆制备方法

血清：

1. 收集全血于不含抗凝剂or含促凝剂的血液收集管中；

2. 室温让样本自然凝血30-60 min，期间不能摇晃或震动；

3. 4℃，2500~3000 rpm离心10 min（小鼠样本转速建议减小，2000rpm左右）；

4. 上清即为血清，将上清转移至新的EP管中；

制备完成后，如不需要立即进行实验，应于4℃或冰上进行分装后保存于-20或-80℃冰箱，避免反复冻融。

血浆：

血浆的制备步骤是类似的，只不过收集管为抗凝管，血液不会发生凝集，颠倒混匀后，直接从第三步往后做就可以啦~

注意：血样采集后1h之内进行处理

血清/血浆的保存

长期保存-80℃，1-2个月内保存-20℃，1周内保存 4℃

*实际上随着时间推移细胞因子都会逐渐降解，少数因子会出现升高现象

推荐-80℃ 3-6个月，-20℃ 15~30天，4℃ 24~48 h

*血清结冰时体积会增加约10%，冻存前，注意预留一定体积空间

血清/血浆的解冻方法

-80℃→-20℃→4℃→常温，逐步解冻。

速溶法不推荐，容易造成蛋白凝集，出现沉淀。

*解冻后高速离心，剧烈震荡，涡旋，等操作均会一定程度降解细胞因子！

有时候制备血清/血浆是为了检测一些细胞因子、趋化因子等等，而从前实验室中最常见的传统检测方法就是ELISA了，很多同学面对着96孔板可能会头大，且每检测一种因子就要用掉好多血清样本。

别慌，CBA技术拯救你，只要你拥有一台最低配置4色流式仪，就可以在低至25-50 μl血清或血浆样本中检测多种因子。

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什么？CBA不是中国男篮吗（划掉），此CBA非彼CBA噢~

CBA（Cytometric Beads Array）是一种利用流式方法学，对液相样本中的多重蛋白进行定量检测的技术。

简单来说，就是利用不同APC荧光强度的微球结合标记区分各种不同的待测因子，再利用双抗夹心法，靠PE检测抗体，对各个因子进行表达量强度的检测。

哇！这听起来就是一个高通量的ELISA~

选择困难患者？不知该检测什么细胞因子或趋化因子？我们有多种经典且经过验证的CBA kit，多种经典因子套餐，总有一款是你的菜。

除此以外，我们还有CBA Flex set可以让大家根据自己的需求定制专属套装，同时检测的因子指标高达30种噢！