我们都知道T细胞亚群中有一群CD4+的辅助性T细胞，可通过分泌细胞因子发挥功能，如促进B细胞产生抗体，CD8＋细胞毒性T细胞发育等。但是在1977年至2001年间就陆续有报道显示，在免疫反应中发现了一群具有细胞毒性的CD4+T细胞（CD4 CTL)，这些细胞的特征是它们能够分泌颗粒酶B（Granzyme B）和穿孔素（Perforin），并以MHC II类限制的方式杀死目标细胞，在抗病毒和抗肿瘤免疫以及炎症中发挥重要作用。CD4 CTL的功能表征表明其具有细胞治疗的潜在意义。据报道CD4 CTL可以由其他辅助T细胞受刺激分化而来，其中大部分跟Th1相关，但是它的分化机制还未被系统地阐明。所以针对CD4 CTL的研究还在继续中。
一、CD4 CTL的分化
T细胞受体刺激后，一小部分初始CD4 + T细胞表达I类限制性T细胞相关分子（CRTAM）。CRTAM + CD4 + T细胞具有分化成CD4 CTL的潜力，其与IL-2共培养后获得细胞毒性活性，被称为Th0 CTL。在既往每个Th亚群的特殊条件下培养，它们也可分化成具有细胞毒性功能的Th1或Th2样CTL（Th1 CTL、Th2 CTL）。如下图中所示，大多数初始T仍是典型的CRTAM-CD4 + T细胞，走的还是向Th分化的途径。也有文献报道部分Th1和Treg在一定条件下会转化为具有细胞毒性的CD4 CTL。
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CRTAM是一种与配体细胞粘附分子1结合的膜蛋白，作为CD4 CTL早期标志物，在TCR刺激下短暂表达，也会在激活后在部分记忆和幼稚CD4+T细胞上表达。表达CRTAM的CD4细胞在Th0极化条件下能够产生IFN-γ，表达高水平的Eomes和GzmB，并在体外分化为CD4 CTL。下图为分化机制。
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①多肽刺激与IL-2信号通路联合使用，可在体外诱导CD4 CTL活性。
②干扰素信号或其他炎症细胞因子信号可协同或弥补低IL-2的情况，促进细胞毒性功能的获得。
③在肽抗原的侧翼残基中包含一个CxxC基序被认为可以提高免疫突触的强度并促进细胞毒性。
④I类限制性T细胞相关分子介导的细胞内信号传导促进Eomes的表达和获得溶细胞活性.
二、CD4 CTL目前报道情况说明
l CD4 CTL只是定义具有细胞毒性的CD4+T细胞，而非描述一个CD4+T亚群；
l 不确定是否所有CRTAM+CD4+T都能获得细胞毒性（CRTAM在刺激48h后会下调，重新激活后又再表达）；
l 在急性流感模型中CD4 CTL显示出与CRTAM表达相关的抗原特异性细胞毒性；memory CD4 CTL是否在炎症部位具有抗原特异性仍有待被有效阐明。
三、CD4 CTL研究的指标选择
相关指标marker选择：
脱颗粒相关：LAMP、LAMP-1(CD107a)、LAMP-2（CD107b）
分泌的因子：Granzyme B、Perforin、IFN-γ、TNF-a、IL-2
相关受体：NKG2A/CD94(抑制）、NKG2D（活化）、CD95/FasL、FCRL6
转录因子：T-bet、Eomes、Bcl-2
其他：CD27、CD28、CD57
健康人CD4＋CTL的标记：
表面标记：CD11a+, CD11b+, CD27−, CD28− CD45RO+, CCR7−
活化标记：CD38 low, CD69−, Bcl2++, Ki67−
分化标记：CD57+, Perforin, GzmB
效应标记：CD57+, FRCL6+, NKG2D+, Perforin+
Treg CTL
小鼠接触介导的Treg抑制模型中Treg CTL主要表型是 GzmB, 而不是 Perforin。
在移植物抗宿主疾病模型中nTreg经CD3/CD28功能抗体和IL-2共同刺激下主要上调的是 GzmA而不是 GzmB，并依赖于Perforin途径发挥杀伤作用，所以treg可能在特定情况下选择性地选择性表达GzmA和GzmB的可能性。
Simian Immunodeficiency Virus(SIV)
在CD8+T耗尽的情况下，由CD4 CTL补充控制感染，SIV特异性CD4主要表型：CD45RA− CD28+ CD95+ CCR7− GzmB+
Human Immunodeficiency Virus（HIV）
HIV特异性CD4+T细胞减少，CD4 CTL扩增并表达Perforin, GzmA, GMP-17/TIA-1，早期病发时CD38+++（激活），Ki-67+（增殖），CCR5，GMP-17/TIA-1, Perforin, GzmB；HIV特异性CD107a+CD4T细胞表达IFN-γ，Gzms A、B、K, Perforin。
Influenza
CD4 CTL主要依赖于Perforin发挥细胞毒性，且CD4 CTL应答在老年人中可能更持久。
Cytomegalovirus（CMV）：
CD28−CD27−CD4 CTL表达GzmB, CD4+CD8dim T细胞对CMV具有更高的特异性。
主要表达的指标：IFN-γ, TNF, MIP-1β，CD107a, Perforin, GzmA、 B、H， granulysin，Perforin，CX3CR1，NKG2D。
*注：其他各类疾病模型指标表达可以查看相关综述（参考文献2）中表格
四、CD4 CTL的功能及免疫治疗应用
CD4 CTL通过识别被感染的细胞或APC类细胞呈现的抗原肽来发挥杀伤功能。杀伤途径也类似于CD8+ T和NK细胞。细胞因子介导的炎症信号和抗原呈递的结合似乎是CD4T细胞获得细胞毒性所必需的，没有IL-2存在且抗原浓度足够的情况下刺激产生的细胞毒性活性主要通过Fas/fasL途径，而脱颗粒途径则需要IL-2和足够浓度的抗原共同刺激，同时其他相关细胞因子也会协同促进CD4 CTL的细胞毒性，如IFN-α、IL-15等。一些病毒感染与恶性肿瘤的发展也有关，因此，表达病毒抗原的肿瘤可以提供CD4 CTL活性的重要靶点，可使用免疫治疗和疫苗接种来诱导针对肿瘤抗原的细胞毒性CD4 T细胞反应。
CD4 CTL在膀胱癌中的免疫治疗应用：传统的免疫检查点抑制剂对膀胱移行细胞癌(TCC)效果甚微，研究者通过单细胞测序、降维聚类分析在TCC肿瘤微环境中发现了这样一群具有细胞毒性的CD4+T异质性群体，作为参与杀伤肿瘤的特殊细胞群体并用流式进行验证。研究结果如图：
Ø CD8+T 和CD4+T 在非肿瘤样本和肿瘤样本中的亚群分布差异，CD4+（右）差异显著，CD8+（左）的并不显著。
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Ø 将样本中CD4+亚群进行大数据分析，根据功能性指标表达差异分成11个亚群。膀胱肿瘤具有多种细胞毒性CD4+T细胞状态。
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Ø 细胞毒性CD4+T细胞分泌GZMB，GZMK，TNFα，IFN-γ对肿瘤细胞具有裂解能力。
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Ø 流式检测膀胱癌中CD4+T细胞中的CD25和Ki67的表达，也证明了CD4 CTL的激活和增殖。
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参考文献：
[1] Takeuchi A , Saito T . CD4 CTL, a Cytotoxic Subset of CD4+ T Cells, Their Differentiation and Function[J]. Frontiers in Immunology, 2017, 8:194.
[2] Juno J A , David V B , Kent S J , et al. Cytotoxic CD4 T Cells—Friend or Foe during Viral Infection?[J]. Frontiers in Immunology, 2017, 8:19-.
[3] Oh D Y , Kwek S S , Raju S S , et al. Intratumoral CD4+ T Cells Mediate Anti-tumor Cytotoxicity in Human Bladder Cancer[J]. Cell, 2020, 181(7).
