如果有人问WB样本制样最后一步是什么,大家肯定可以脱口而出,100℃煮样5min。确实,对于大部分蛋白来说这个步骤是没有问题的,而且是必须的,但是对于跨膜蛋白,情况就不一定了。
有研究发现,如果在检测转铁跨膜蛋白SLC时常规的加热变性,即使是最好的一抗也无法检测到目的蛋白,这是怎么回事呢?今天小优细节君就和大家一起来通过一篇研究一探究竟。
什么是SLC?
我们先了解下什么是SLC,SLC即Solute carriers,溶质载体,是一组膜转运蛋白,该家族蛋白包括400多个成员,大部分定位于细胞膜上,它们的主要功能是负责各类溶质的跨膜运输。作者在这篇研究中的对象主要是SLC11A2(DMT1)和SLC40A1(FPN1)这两个蛋白,他们的转运底物都是Fe2+。
话不多说,进入正题
首先作者在293细胞上过表达了Fpn1,但是在WB检测时发现蛋白并没有跑下来(在蓝色箭头所指位置),猜测应该是蛋白不溶解或者发生了聚集。
图1 Fpn1过表达检测
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这里不得不提下全膜做WB的重要性,可以帮助我们了解更多的信息。如果只是裁膜做,就会发现目的区域没有条带,进而怀疑是试剂或者操作的问题,那就是另外一个story了。
溶解 or 聚集?
前面提到可能有两个原因,溶解或者聚集,接下来作者做了一个正交实验来排查问题。如果是溶解问题,使用三种不同的细胞裂解条件:RIPA裂解缓冲液(最常用的)、RIPA加超声处理(进阶)或者跨膜提取试剂;如果是聚集问题,使用加热或者不加热两种办法。
结果如下图,在左边加热(heating)的样本中,无论哪种裂解条件,转染的Fpn1基本都还在凝胶的顶部,没有看到目的条带。而右边不加热(no heating)的样本出现了Fpn1的条带,大概在63KD。可以初步得出结论,加热与否是影响Fpn1检测出条带的重要因素,比裂解条件更重要。
图2 加热与裂解条件对Fpn1蛋白检测的影响
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为了进一步确认和排除其他因素,作者又使用了三种不同的上样缓冲液, 5%β-巯基乙醇(BME,最常用),4M尿素,以及5%β-巯基乙醇+4M尿素。
结果如下图所示,当Fpn1蛋白被加热变性后时,无论哪种loading buffer都没有检测到目的条带。而未加热煮沸的样本,三种loading buffer都可以清楚检测到Fpn1。所以再次肯定了这个结论,Fpn1蛋白不加热是WB检测的最关键因素。
图3加热与loading buffer对Fpn1蛋白检测的影响
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是否只有这个蛋白是这样的,不具有广泛性?
作者又做了另一个铁转运胞膜蛋白DMT1(SLC11A2),也设计了类似的实验来验证加热是否是最关键的影响因素。我们直接看结果图吧,加热过的样本几乎看不到DMT1的蛋白条带,而未加热的样本出现了75kDa的目的条带。
图4 加热与细胞组分对DMT1蛋白检测的影响
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会不会加热只对外源转染的有影响,对内源表达的没影响或者有差异呢?
显然作者也想到了这一点。接下来,他对12个人源细胞系进行了加热和不加热的WB检测。结果显示,如果不加热样本,大多数细胞中(10/12)都可以检测到内源性DMT1的表达。而经过95˚C加热5分钟后,几乎都检测不到了,其中一些还是聚集在凝胶顶部。
图5 加热对不同细胞系内源DMT1蛋白检测的影响
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Fpn1的结果有点意外,因为大部分细胞系加热和未加热之间没有明显差异,除了前面做的293转染的样本。后面作者又补充了几个实验,验证了这个条带确实是特异性的,包括siRNA和激活剂,抑制剂处理,但对于这个结果没有更好的解释,感兴趣的同学可以再深入研究一下。
图6 加热对不同细胞系内源Fpn1蛋白检测的影响
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总结
以上这么多结果,足以给我们一些启发,对于SLC这类跨膜蛋白或者延伸到其他的膜蛋白,在WB检测不到目的蛋白或者条带太弱的情况下,我们可以尝试不加热样本,或者低温加热(50-70℃ 15min或者 37℃ 30min)来避免蛋白聚集在凝胶顶端。
有小伙伴问,为什么这么重要的信息,参考文献都不写清楚呢?这确实是个问题,小优细节君发现,目前的参考文献中对于WB步骤,都是标准化的步骤。也许其他蛋白标准化流程都可以做出来,而个别膜蛋白作者进行了优化而没有写明。
最后再辩证一下,整篇文章提到了膜蛋白不煮样的重要性,但是呢不是所有跨膜蛋白都要不加热制样,你可以看到文中做的内源性Fpn1就是不一样的结论。因此,小优细节君建议在做每一个新蛋白之前,一定要充分摸索样品制备的最佳条件,从而获得出色的结果。
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参考文献: