Nat Commun如何深入研究一个酶，你知道吗？

酶学研究一直是热门领域研究的重点，近几年相关文章也是不断飙升。酶是生命活动中的“催化剂”，主宰着生命活动的进程。酶学研究对于人们认识生命活动的本质和规律是十分重要的，酶学研究中重大发现的理论上的突破也多次获得诺贝尔奖桂冠。
今天我们看到的这篇研究是来自美国费城威斯达研究所的Kazuko Nishikura教授2021年3月发表在Nat Commun上面的文章。Kazuko Nishikura教授致力于RNA编辑的研究，也是最早在哺乳细胞中发现ADAR1的研究者。这篇文章展现了Kazuko Nishikura对ADAR1 RNA编辑酶在癌症细胞中调节R-loop的形成和基因组端粒稳定性中的新发现。
文章条理清晰，数据详细扎实，非常适合于研究学习。文章中也用到了多种实验方法，如果大家对某些实验方法感兴趣，可以去看文章的补充材料或者找小优咨询哦！
 

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ADAR1 RNA编辑酶在癌症细胞中调节R-loop的形成和基因组端粒稳定性
ADAR是一个作用于腺苷到肌苷（A-to-I RNA editing）的RNA编辑过程的重要的酶。ADAR1具有两个亚型，p150和p110。P150主要存在于细胞质，而P110主要存在于细胞核。前期的研究已表明P150介导的IFN信号通路抑制降低了肿瘤对免疫检查点阻滞的响应，这篇文章作者对p110进行进一步研究。
 

ADAR1作用以及上下游通路示意图

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01 ADAR1的缺失导致DNA的损伤和端粒异常
首先故事开始于作者发现ADAR1基因敲除的HeLa细胞的延时摄影显示有异常形状的细胞核出现，在有丝分裂过程中发生阻滞（Fig A）。进一步检测发现，这些细胞中桥核，微核和多核显著增加。根据这些观察到的现象，作者猜测ADAR1基因和DNA损伤之间可能存在显著影响（Fig B）。
 

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a,Hela细胞用siControl或者siADAR1进行转染，然后用CellLight Tubulin-GFP处理，细胞核位置通过用SIR-DNA试剂对DNA染色。
b,至少200个siControl或者siADAR1转染的Hela细胞用来检测细胞核异常。
作者进一步使用端粒FISH和γH2AX免疫染色发现ADAR1敲除的HeLa细胞中，端粒异常引起的变异损伤增多（黄色箭头指示）（Fig C）。
 

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c,ADAR1敲除的细胞中端粒DNA损伤。端粒FISH和γH2AX免疫染色显示端粒异常导致的焦点显著增加（TIF，黄色箭头标记），表明在ADAR1敲除的HeLa细胞中，端粒重复DNA损伤和染色体异常有关。
WB实验显示DNA损伤标志物例如DNA-PKcs，H2AX和磷酸化的RPA32在ADAR1敲除的细胞中显著上调（Fig D）。作者猜测ADAR1的缺失可能会导致R-Loops的聚集（Fig E），从而会引起DNA的损伤，端粒异常和有丝分裂阻滞，从而开始第二部分的研究。
 

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d,用siControl和siADAR1 RNA转染的Hela细胞提取物通过WB检测。
e,R-loop结构包含一个RNA聚合酶II在RNA链中形成的RNA:DNA杂交。

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02 ADAR1缺失显著增加RNA:DNA杂交的形成
基于以上观察，作者开始了第二部分研究。作者进行了斑点实验发现ADAR1的缺失会显著增加RNA:DNA杂交的形成（Fig A and B）。使用Escherichia coli-RNase H（用于消化RNA链中RNA:DNA杂交链）会消除斑点信号（Fig B）。而ADAR2缺失的对照实验则显示ADAR2对于RNA:DNA杂交几乎没有影响（Fig C），显示ADAR1对R-Loop的特异性调节。
 

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a,S9.6抗体识别特异性的RNA:DNA而不是DNA:DNA或者RNA:RNA核苷酸对。
b,S9.6抗体信号被E.coli-RHase H处理后破坏，确认RNA:DNA杂交的特异检测。
除了ADAR2的对照以外，作者还使用了酶活位点缺失的ADAR1突变体进行进一步对照实验，这也是酶活研究的常用方法。使用慢病毒表达体系进行转染，ADAR1基因的过表达显著抑制了RNA:DNA杂交的形成，而突变体ADAR1p110-E912A不能抑制杂交的形成（Fig E）。
 

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e,内源ADAR1敲除之后通过转染ADAR1野生型而不是ADAR1酶活位点突变型造成RNA:DNA杂交的形成增加。

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03 ADAR1敲除引起RNA:DNA杂交在端粒重复区域聚集增加
作者接下来进一步研究ADAR1p110是如何控制R-loop的形成。作者对DNA:RNA杂交免疫共沉淀产物（DRIP）进行定量PCR，结果表明，ADAR1在已知的转录起始位点例如NEAT1，JUN，PMS2和CLSPN都没有显著作用。看来事情没有预想这么简单，作者进一步查阅文献，发现着丝粒和端粒重复区域也被报导对R-Loop的形成具有显著影响，标志基因是Alu和LINE。于是作者将DRIP产物又进行了斑点杂交试验，结果表明ADAR1敲除会引起RNA:DNA杂交在端粒重复区域聚集增加(Fig B)。
 

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b.DRIP产物通过基因组的DNA斑点杂交实验进行检测。ADAR1敲除导致端粒重复序列上RNA:DNA的杂交形成增加，会被RNase H处理破坏。

04 ADAR1促进RNase H2酶对端粒R-loop识别
已知ADAR1是一个作用于腺苷到肌苷（A-to-I RNA editing）的RNA编辑过程的重要的酶，而在前面的研究又发现ADAR1的对于RNA:DNA在端粒重复区杂交聚集有影响，这个影响和ADAR1本身的功能又是什么关系呢？作者对于这个问题又进行了进一步的更加细致的机制研究。
作者猜测RNA:DNA杂交包含A-C错配碱基对可能有两形成途径，变体TCAGGG和TTGGG(Fig A and B)。
 

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a,b RNAs transcribed from the region containing four TCAGGG (green) / TTGGGG (orange) variant repeats surrounded by TTAGGG (gray) canonical repeats form an RNA:DNA hybrid containing four A-C mismatches by in cis slipped hybridization to the C-strand DNA containing canonical TTAGGG (CCCTAA) /TTGGGG (CCCCAA)  repeats.
作者发现，ADAR1的缺失会引起这两种RNA:DNA的聚集（Fig C and D）。
 

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c. DRIP产物通过斑点实验检测UCAGGG变体和UUAGGG重复G-strand RNAs。
d. DRIP产物通过斑点实验检测CCCTAA变体和CCCCAA重复C-strand RNAs。
接下来，作者纯化ADAR1蛋白进行体外实验。作者使用了昆虫表达体系，用构建好杆状病毒载体感染Sf9昆虫细胞，从而获得表达的重组蛋白。然后作者使用了ni 填料进行纯化。体外实验也表明，ADAR1可以编辑端粒RNA:DNA杂交中的A-C错配。
 

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a,b,c. 使用重组ADAR1蛋白构建的包含A-C或者C-A错配的端粒重复序列（a：dsRNA，b,c：RNA:DNA杂交）体外编辑实验。PCR产物使用Sanger测序。
而对于端粒重复的RNA:DNA杂交中A-C错配的编辑又促进了他们被RNase H2酶识别。实验表明，RNase H2不能降解端粒重复RNA:DNA杂交中含有六个A-C错配的RNA链，开始降解包含四个A-C错配的RNA链，而用I:C代替所有的A-C错配之后可以引起RNase H2酶的高效降解。
 

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b,RNase H2不能降解包含6个A-C错配的端粒重复的RNA:DNA杂交的RNA链，但是开始降解包含4个A-C错配的端粒重复的RNA:DNA杂交的RNA链。用I:C匹配的碱基对替换所有的A-C错配导致RNAse H2对RNA链的高效降解。

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综上，作者发现了在癌症细胞中ADAR1可以调节端粒上R-loop的形成和基因组稳定性。ADAR1编辑RNA:DNA杂交中的A-C错配变为I:C配对，从而促进RNase H2酶对端粒R-loop的识别。由此表明ADAR1可以作为抗肿瘤免疫研究的有价值的治疗靶点。
就像这篇文章一样，在酶研究中我们常常会需要用到纯度较高的酶进行体外实验，构建并纯化出一个我们需要的酶是实验的关键。优宁维为您提供从质粒构建，蛋白表达到蛋白纯化全套解决方案。