一、肿瘤血管再生背景介绍
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血管生成，即从原已存在的血管中生成新血管，这在肿瘤发生中扮演了重要角色。良性肿瘤细胞存在于休眠状态下，难以获取足够血液供应时会受到影响。但当休眠肿瘤细胞血管生成被激活，以及分泌出的因子会诱导内皮细胞发芽和趋化成为肿瘤团块时，会出现“血管生成开关”。
二、肿瘤血管的免疫机制及热点研究靶标
1、肿瘤血管引起肿瘤微环境的免疫抑制
·mDCs和M1型TAMs产生抑制肿瘤血管生成的细胞因子(IFN-α,IL-12, IL-18或TNF)和趋化因子(CXCL9, CXCL10或CCL21)，同时，适应性免疫细胞CD8+T细胞和TH1细胞分泌IFN-γ，一种在TME中抑制血管生成并诱导血管正常化的强效细胞因子。
·未成熟DCs (iDCs)、MDSCs、M2型TAMs和表达Tie2的巨噬细胞通过分泌VEGF、IL-10、Bv8和MMP-9显著促进肿瘤血管生成。此外，Treg、TH2和TH17细胞还能释放促血管生成因子，如VEGF、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17。
·mDC, CD8和TH1促进TAM M2→M1；MDSCs和Treg促进TAM M1→M2；
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2、VEGF/VEGFR信号转导途径
在内部肿瘤团块缺氧环境下，缺氧诱导因子-1- (HIF-1) 的二聚蛋白复合体得以保持稳定，并激活众多导致血管生成过程的基因的表达。HIF-1 诱导的蛋白包括血管内皮生长因子 (VEGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，前者促进血管渗透性，后者促进内皮细胞生长。血小板源性生长因子 (PDGF)、血管生成素-1 (ANG-1)、血管生成素-2 (ANG-2) 等其他分泌因子会促进趋化性，而肝配蛋白信号转导会控制迁移和细胞间黏附，从而引导新形成的血管。
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3、内皮免疫细胞屏障
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血管生成肿瘤血管系统中的内皮细胞形成了免疫细胞浸润肿瘤组织的屏障。
免疫细胞浸润因促血管生成因子诱导的肿瘤内皮细胞能量缺乏而受到限制，其特征是缺乏内皮粘附分子。此外，内皮细胞表达免疫抑制分子，如抑制白细胞功能的免疫检查点和诱导免疫细胞凋亡的分子。其他血管生成介导的肿瘤免疫逃避机制包括促血管生成因子对免疫细胞的直接抑制作用，以及由于肿瘤血管系统的麻木和渗漏而存在的缺氧环境。
三 肿瘤血管再生的实验思路推荐
1、通过单细胞测序鉴定乳腺癌症患者的内皮细胞细胞图谱
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来自9例BC患者的26,515个细胞（包括8433个EC）进行了单细胞转录组测序，并将其与已发表的肺肿瘤EC分类进行比较。血管生成EC在表型上相似，而其他EC亚型则不同。分析揭示了EC和免疫细胞之间已知但以前未报道的受体-配体相互作用，表明乳腺EC亚型参与了免疫反应。
高通量单细胞测序可以解决什么问题？
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2、功能性细胞因子VEGF&其他相关蛋白的定量检测
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血管内皮生长因子（vegf）的量化：不同检测方法学：
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A: ELISA；
B: Luminex；
C: MSD；
D: FRET；
E: CBA；
F: AlphaLISA；
G: FirePlex
CBA：流式液相多重蛋白定量技术
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CBA产品推荐
| 指标 | 货号 | 品名 | 规格 | Beads位置 |
| IFN-γ | 558269 | (CBA) Human IFN-γ Flex Set | 100 Tests | E7 |
| IL-2 | 558270 | (CBA) Human IL-2 Flex Set | 100 Tests | A4 |
| IL-4 | 558272 | (CBA) Human IL-4 Flex Set | 100 Tests | A5 |
| TNF | 558273 | (CBA) Human TNF Flex Set | 100 Tests | D9 |
| IL-6 | 558276 | (CBA) Human IL-6 Flex Set | 100 Tests | A7 |
| IL-8 | 558277 | (CBA) Human IL-8 Flex Set | 100 Tests | A9 |
| IL-1β | 558279 | (CBA) Human IL-1β Flex Set | 100 Tests | B4 |
| MCP-1 | 558287 | (CBA) Human MCP-1 Flex Set | 100 Tests | D8 |
| FGF | 558327 | (CBA) Human basic FGF Flex Set | 100 Tests | C5 |
| VEGF | 558336 | (CBA) Human VEGF Flex Set | 100 Tests | B8 |
| TGF-β1 | 560429 | (CBA) Human TGF-β1 Single Plex Flex Set | 100 Tests | B6 |
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四：深度高维多色免疫细胞分型检测
1、免疫细胞&指标选择
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2、案例分享：实体瘤患者外周血循环内皮细胞及其亚群的优化多参数流式细胞术分析案例
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3、案例结果展示--用于分析CEC及其亚群的门控策略:
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A.单门用于去除大细胞和细胞团块。
B.MNCs门用于排除碎屑、死细胞、血小板和粒细胞。
C.门用于排除共表达CD45抗原的造血细胞。
D.FMO对照组设为阴性对照组。
E.制作门以描绘CD34+细胞。
F.CD34+细胞分别用CD133和CD146染色以确定EPC和mCEC。
G.aCEC和rEC通过添加CD106进一步定义。
五、优宁维提供的产品解决方案
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Reference：
1.Optimized multiparametric flow cytometricanalysis of circulating endothelial cells and theirsubpopulations in peripheral blood of patientswith solid tumors: a technical analysis.
2.Huinen, Z.R., Huijbers, E.J.M., van Beijnum, J.R. et al. Anti-angiogenic agents — overcoming tumour endothelial cell anergy and improving immunotherapy outcomes. Nat Rev Clin Oncol 18, 527–540 (2021).
3.Single cell atlas identifies lipid-processingand immunomodulatory endothelial cellsin healthy and malignant breast
4.An Optimized Flow Cytometry Protocol for Analysis of Angiogenic Monocytes and Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Blood
