文章背景：
Reference:OMIP-086: Full spectrum flow cytometry for high-dimensional immunophenotyping of mouse innate lymphoid cells
OMIP是国际流式学会旗下Cytometry PART A杂志中的专栏，全称为：Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels。目的是为多色方案的科研人员提供素材，减少其方案的开发时间，提高实验效率。
实验背景
固有淋巴细胞（Innate Lymphoid Cell，ILC）是一类富集在黏膜表面缺乏抗原特异性受体的淋巴细胞，其在防御、组织重塑和修复、炎症和代谢稳态中发挥不同的作用。
虽然缺乏抗原特异性，但ILCs在表型和功能方面与传统的T辅助细胞（Th）表现了显著的同源性，因此，它们同样被分为ILC1、ILC2和ILC3三个不同的亚群（比对Th1、Th2、Th17）。
Reference:Immunopathology of inflammatory bowel disease
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此外，ILCs亚群现已扩展到包括NK和LTi细胞，它们在表型和功能上分别与ILC1和ILC3相似，但表现出不同的发育轨迹。
Reference:Innate lymphoid cells — how did we miss them?
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尽管ILCs在生物环境中非常重要，但该群体不论在人还是小鼠的淋巴或非淋巴系统中占比都很少，仅为CD45+的1-5%。正是因为它的稀少，在单细胞水平上获得足够的信息对于准确地认识ILC是非常重要的。
该实验样本为成年BALB/c小鼠，取材肺组织及小肠固有层。对ILC亚群包括ILC祖细胞（ILCP）、ILC1、ILC2、NCR+ ILC3、NCR-ILC3、CCR6+LTi样ILC3和成熟自然杀伤（NK）细胞群进行分型，通过包含亚群特异性细胞因子指标和增殖指标，进一步说明了ILC和NK细胞对刺激反应的功能。
指标选择
ILCs产生于骨髓内常见的淋巴样祖细胞（BM），通过一个连续的阶段产生ILC祖细胞（ILCP）。
ILCPs最初备认为只出现在骨髓中，但现在它也被认为作为一个驻留的群体存在在新生儿和成人的循环系统中，包括肺、皮肤和次级淋巴组织。在早期发育过程中，转录因子PLZF（由编码：Zbtb16）的表达决定了ILCs分化发育的不同，因此PLZF+ ILCPs仅限于ILC1、ILC2和ILC3而不包括LTi或NK细胞的产生。除此之外ILCPs还高表达IL-18Rα，因为IL-18通过IL-18Rα提供增殖和分化的信号。ILCPs和ILCs亚群相较于T细胞，都有更高的IL-7Rα表达，同时在ILCs亚群上不表达且通常被认为识别其他淋巴、髓系细胞的指标，统一定义为谱系阴性，也就是我们常说的Lin。[流式专家—罗工秘籍-Lin的选择]（点击查看）
ILC1的主要特征是表达转录因子T-bet（编码：Tbx21）的组成性表达，这是表达IFN-γ的核心。由于与NK细胞相似，ILC1表面也表达NKp46，但我们仍可以通过CD49a或TRAIL表达以及CD11b和CD49b的缺失对两个亚群之间进行特异性区分。
ILC2特异性表达转录因子GATA-3
与Th2类似，ILC2在控制寄生虫感染中发挥关键作用，产生IL-5和IL-13来维持过敏原诱导的过敏性反应。已知ILC2与促炎功能相关的细胞外标记物IL-33R（ST2）和KLRG1表达并非一成不变，而是取决于对炎症信号的应答反应。
除此之外，一些文章表面在人血及小鼠肺组织中，ILC2在特定的炎性环境下有转分化ILC1-Like（表达T-bet和IFN-γ）和ILC3-Like（表达RORγt和IL-17a）的现象。
ILC3是一个异质亚群，通过IL-1β和IL-23介导的激活后产生IL-17A和IL-22，在对抗包括真菌和细菌在内的细胞外微生物中发挥了广泛的作用。ILC3分化和功能依赖于转录因子RORγt（编码：Rorc）。同时，根据NKp46和CCR6的表达差异，小鼠ILCS可进一步分为3种亚型；即NKp46+CCR6-（NCR+）、NKp46-CCR6-（NCR）和NKp46-CCR6+（CCR6+ LTi-like）ILC3s。此外，NCR+ILC3与ILC1都表达转录因子T-bet，因为这对NKp46的表达至关重要，同时也拥有分泌IFN-γ的能力。
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圈门逻辑
Lin：
CD3, CD4, CD5, CD11b, CD11c, CD19, B220, F4/80, FcεR1, Gr1, TCRβ, TCRγδ, Ter119
ILCs：
CD45+Lin-IL-7R+
ILCPs：
IL-18Rα+PLZF+
ILC1：
T-bet+RORγt-ST2-CD49b-IL-18Rα+NKp46+CD49a+/-TRAIL+/-
ILC2：
GATA-3+T-bet-RORγt-KLRG1+/-ST2+/-
NCR+ILC3：
RORγt+T-bet+/-NKp46+CCR6-
NCR-ILC3：
RORγt+T-bet+/-NKp46-CCR6-
CCR6+ LTi-like ILC3：
RORγt+T-bet+/-NKp46-CCR6+
结果展示
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全光谱流式细胞术的另一个好处是，在排除细胞碎片、双细胞细胞后，另一个好处是能够通过绘制405 nm紫激光捕获的SSC与488 nm蓝色激光SSC-B的侧散射（SSC）来去除红细胞污染，最后圈取CD45+活细胞群
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用IL-7Rα 和lineage定义ILCs
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ILCPs：IL-18Rα+PLZF+
肺和小肠固有层ILC1、ILC2和ILC3亚群的分型
关于ILC2，值得注意的是，在体外刺激的小肠固有层ILC2中，ST2的表达基本缺失。
此外，虽然小鼠肺ILCs缺乏CD4表达，但肠道LTi-like ILC3可分为CD4+和CD4-，因此，在lineage的cocktail中包含CD4可能会在组织特异性的基础上影响ILC3亚群的特征。
细胞因子刺激条件
PMA/Ionomycin/BFA体外刺激5h。
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肺与小肠固有层不同ILCs亚群检测细胞因子（IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17A和IL-22）表达情况和细胞增殖（Ki-67）。
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肺和小肠固有层内的NK细胞，以及肺组织驻留的NK（trNK）和循环NK（cNK）细胞的特征。
