答疑解惑
ELISPOT实验中有许多组分，包括抗体对、检测板、试剂盒、细胞及培养基的类型、刺激物与显色系统等，如何针对自己实验的需求选择适合的组分呢？
本期答疑解惑就针对各个组分的区别及特点进行阐述，希望能够帮助大家选择适合的实验组分~
Q1：ELISA的抗体对可以用于ELISPOT吗？
达咩达咩的哟~
在ELISA实验中使用的抗体对并不意味着满足ELISPOT的需求，这是源于两项技术的原理、样本类型及操作流程不同（详情见公众号文章“单细胞分泌细胞因子动态检测），使用ELISA体系中的抗体对有可能造成细胞因子捕获及斑点显色失败等结果，因此我们建议选择适用于ELISPOT检测的抗体对。（PS.ELISA的显色体系不适用于ELISPOT）
Q2：检测板的材质怎么选？NC膜还是PVDF膜？
硝酸纤维素膜（NC膜）最先应用于ELISPOT检测中（1998，Mollwe SA、Borrebaeck CA），在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot等实验中也较为常见，PVDF膜则是在技术后续的更新发展进程中得到应用（1995，Schielen P）。
表1：NC膜 VS. PVDF膜
△点击放大图片
两种材质各有优劣，但在ELISPOT检测中为了得到更好的实验结果，我们推荐使用PVDF膜材质的检测板：
1、PVDF膜在蛋白的结合能力中表现更优，约为125-200ug/cm2；
2、PVDF膜也具有更好的机械强度和化学耐受性，在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；
Q3：试剂盒有哪些类型？
商品化的ELISPOT检测试剂盒有即用型（预包被抗体）、非即用型（自行包被抗体），以及经验证的抗体对，可根据实验需求选购。
即用型
预先包被了捕获抗体，可直接进行细胞铺板、刺激及孵育等后续操作，无需预浸润处理，节省实验时间。
非即用型
需进行预浸润及抗体包被流程，可通过调整板底抗体浓度优化实验结果，灵活性更好。
经验证的抗体对
对板材、显色系统没有限制，可自行选择，便于实验条件的探索与优化。
Q4：细胞悬液制备、冻存过程中，培养基如何选择？
我们建议使用以下体系进行培养与冻存的操作
培养基：RPMI 1640（含双抗：100 µg/mL 青霉素 + 100 µg/mL 链霉素）
冷冻培养基：RPMI 1640（含2mMl-谷氨酰胺），+ 20% FCS和10% DMSO
表2：细胞悬液培养与冻存体系
△点击放大图片
Q5：刺激剂如何选择？
这是一个常被问到并且万众瞩目的问题，记得划重点哦！
有两个划分的维度，首先是特异性的维度，其次是检测细胞类型的维度。
△点击放大图片
A：非特异性阳性对照刺激物
来源于人的样本：
PHA（植物凝血素）、PMA（佛波酯）、CD3单抗；
来源于鼠的样本：
ConA（刀豆蛋白）、PMA（佛波酯）；
B：T细胞特异性刺激物
样本的刺激：
特异性抗原——蛋白（S蛋白、N/M蛋白、辅助蛋白）、肽段、肽库、细胞；
阳性对照：
CD3单抗、T细胞表位肽、重叠多肽库、蛋白；
C：B细胞特异性刺激物
样本的刺激：
注射疫苗后短时间内（约为3-9天内），B细胞已经被活化，无需刺激可直接进行检测，
若免疫效果较差或以记忆B细胞形式居多，则使用IL-2+R848进行刺激
阳性对照（记忆B细胞）：
细胞在涂有物种特异性免疫球蛋白的孔中孵育
Q6：显色体系有哪些？
你有没有见过五彩斑斓的斑点图？
为什么会产生这样的结果呢？——显色体系
在酶标ELISPOT中，有两个因素决定了最后的显色结果：酶联物（HRP、ALP、Silver）、显色底物（AEC、TMB、BCIP/NBT）
1.银染系统 2.HRP+TMB
www.ucytech.com 图片来源：AID
△点击放大图片
3.HRP+AEC 4.ALP+BCIP/NBT
图片来源：AID 图片来源：AID
△点击放大图片
各个显色系统有其特点和优势，可按照试剂盒要求或实际需求选择~
