前言
ELISPOT是一种基于单细胞水平的定量分析免疫测定法，对接受刺激后活细胞分泌的细胞因子、免疫球蛋白或其他靶蛋白，进行动态全过程的捕获与检测；FluoroSpot是ELISPOT的多重版本，该测定结合了ELISPOT的灵敏度和荧光标记检测的优势——实现单细胞水平多个指标的同时测定。二者的区别在于检测模式：ELISpot依赖于酶促反应，而FluoroSpot则利用荧光。后者为同时对几种分析物进行多重分析开辟了道路，从而能够研究具有不同功能特征的细胞群。
图1：（案例）通过ELISpot和FluoroSpot分析检测分析食蟹猕猴外周血单个核细胞（PBMC）分泌的IFN-γ和IL-2。
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自1983年技术方法被正式建立之后（Czerkinsky C）[1],ELISPOT在实验板材、检测指标等方面不断发展优化，并广泛应用在疫苗效果评估、人群免疫力变化评估中，被视为标志性技术。本期就针对ELISPOT技术应用中常见的样本相关常见问题进行分析与解答。
图:2：Workflow（本期为样本制备部分）
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Q1：可应用ELISPOT检测的细胞类型有哪些？
原则上任何可以分泌蛋白质的细胞都可以进行检测，目前ELISPOT主要用于鉴定：抗原激活分泌细胞因子的T细胞、外周血&脾脏细胞中分泌抗体的B细胞。
其次，新鲜和冷冻保存的PBMC都可用于ELISPOT和FluoroSpot分析；贴壁细胞在进行检测步骤之前，需要进行裂解步骤，以从ELISPOT板上去除所有细胞。
Q2：检测样本有限制吗？
常用的样本包括人、小鼠、猴，因此特殊物种需要确定是否能产生想要研究的细胞因子。一些动物样本只有在体内受到适当抗原刺激后，才会分泌细胞因子，ELISPOT是体外检测，故而不能满足一些特定的分泌条件。
Q3：血液样本改如何储存及运输？
全血样本应在室温（20-26℃）条件下，储存不超过8小时；
抗凝血剂推荐肝素+柠檬酸盐，这两种物质经测定显示不会对细胞功能的不利影响；不推荐EDTA（EDTA通过钙螯合抑制凝血，钙螯合在抗原特异性再刺激期间损害细胞因子诱导）。
Q4：使用PBMC样本进行检测时，有哪些需要注意的事项？
首先，单核细胞作为T细胞的抗原递呈细胞（APC）至关重要，单核细胞数量过少会导致T细胞ELISPOT/FluoroSpot测定中的斑点数降低，特别是冷冻保存的样本，因此需补充单核细胞。
其次，PBMC制剂中死细胞的存在会影响T细胞与B细胞的测定结果，建议在样本制备时，进行细胞计数并计算细胞活率。细胞活率大于80%的样本即可进行检测，否则由于操作过程中的损失及自然凋亡，最后检测时形成的斑点数也会减少。
图3：人IFN-γ T细胞ELISPOT结果示例（银染）：2x105PBMC/孔[2]
单核细胞耗尽样品 正常样品
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Q5：对检测板的预处理是必要的吗？
上文我们说到，ELISPOT在板材上有了很大改进，即将原来普通的塑料板改进为下图列举的覆PVDF膜的检测板。PVDF膜提供更大的膜表面，增加了可以结合的捕获抗体数量，这对于得到成功的 ELISPOT 检测结果至关重要。
图4：高倍率下的 PVDF 膜类似于海绵
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PVDF膜需要浸湿才能更好地结合所需量的捕获抗体，所以对于检测板的预处理是非常必要的，因为乙醇使膜具有亲水性，故首选乙醇进行预处理。此外，也需使用适宜的捕获抗体浓度（因分析物而异，通常为 15 μg/ml）来优化斑点外观。
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图5：经预处理&未经预处理实验结果对比[3]
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图6：抗体浓度对显色斑点数的影响[3]
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（数据来源：www.mabtech.com）
Q6：如何设置实验对照？
对照设置如下表建议：
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参考文献
[1]Czerkinsky C, Nilsson L, Nygren H, Ouchterlony O, Tarkowski A (1983) A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods 65(1–2):109–121
[2]www.ucytech.com
[3]www.mabtech.com
