一、TIL背景介绍
TIL全称肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes），是肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，包括T细胞及NK细胞等。大多数情况下以CD3+、CD8+和T细胞为主，是机体淋巴细胞侵入到肿瘤组织中，并对肿瘤起识别、抵抗和攻击作用的细胞群体。
肿瘤组织中的TIL细胞（橙黄色）
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二、常见的免疫机制及热点研究目标
免疫机制及热点研究目标：overview
探索肿瘤微环境更多未知（代谢、调控基因、免疫抑制机制）——单细胞多组学
肿瘤微环境中免疫细胞的功能特性及动态变化——流式检测
细胞因子的调控——多因子检测
抑制性免疫检查点（PD-1、TIGIT、TIM3…..）
1、免疫机制及热点研究靶标——T cell
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1.TC、TH、Tregs
2.CTLs、颗粒酶、穿孔素
3.PD-1和其他抑制分子↑—— T细胞衰竭
4.外周血T细胞浸润到肿瘤
5.幼稚的CD8 T/CD4 T 过渡 衰竭；静止的Tregs抑制
6.TEFF减少，TEX和Tregs积累
2、免疫机制及热点研究靶标——B cell
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1.体液免疫细胞
2.CD20+ TIBs 可能是作为APCs增强细胞溶解T细胞反应
3.ICIs 诱导-T滤泡辅助细胞和B细胞-活化
4.在 B- CLL中经IL-21激活后可产生GranzymeB 获得细胞毒能力
5.活化的B细胞-浆B细胞-产生清除癌细胞的抗体
6.可通过向CD4 TH细胞呈递抗原促进CD8 T细胞的活化
3、免疫机制及热点研究靶标——NK cell
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1.先天淋巴样细胞，发挥细胞毒性功能
2.细胞溶解颗粒（颗粒酶 穿孔素）直接消灭肿瘤细胞
3.通过促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α）、趋化因子（CXCR1、CXCR2）
4.招募cDC1细胞进入TME促进抗肿瘤免疫，而肿瘤细胞可产生前列腺素E2损害NK细胞功能，导致免疫逃避
5.激活 与穿孔素和颗粒酶一起发挥细胞毒性功能
6.NK功能缺陷——肿瘤细胞通过分泌免疫抑制因子（IL-6、TGF-β... ）和表达抑制性受体配体（PD1、 PDL1）
4、免疫机制及热点研究靶标——Mye cell
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1.单核细胞-巨噬、DC
2.抑制性TAM和cDC2s的积累，但CD16+单核细胞和cDC1s减少
3.pDCs-I型IFN，具有免疫原和耐受原功能；专业的APCs调节抗肿瘤免疫反应；cDC1s-分泌CXCL9和CXCL10等趋化因子促进抗肿瘤免疫
4.cDC2s促进广泛的CD4 T细胞介导的免疫反应
5.吞噬作用/产生可溶性因子-杀伤肿瘤
6.血管生成、纤维化和免疫监视-调节肿瘤
7.分泌不同的分子，促血管生成或抗血管生成的功能
8.IL-12、CD86——介导T细胞活化/抑制
三、TIL常见的免疫机制及研究方法学
一：通过单细胞测序揭示肿瘤浸润T细胞在不同癌症间的异质性
1、方案设计
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样本来源：316例患者，21种癌症类型，邻近正常组织、肿瘤、外周血
TCR序列，以表征T细胞的扩增和动态。
2、结果解读
共鉴定出17个cd8 +和24个CD4+元簇，至少80%的癌症类型共享这些元簇。
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血液、正常组织、肿瘤三种样本：
CD8+ T细胞组成 CD4+ T细胞组成
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富含肿瘤的元簇表现出扩增和持续增殖
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高通量单细胞测序可以解决什么问题？
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2、炎症因子定量检测
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方案设计
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通过流式细胞术分析中CD4、CD25和FoxP3的染色测定患者血液中的循环调节性T细胞
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结果解读
根据血清中细胞因子检测，患者促炎细胞因子IL-12p70、IL-1b明显降低，TGFb略有升高；Th1受抑制，富含Tregs和TGF-β。
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CBA：流式液相多重蛋白定量技术
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| 指标 | 货号 | 品名 | 规格 | Beads位置 |
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| IL-4 | 558272 | (CBA) Human IL-4 Flex Set | 100 Tests | A5 |
| TNF | 558273 | (CBA) Human TNF Flex Set | 100 Tests | D9 |
| IL-6 | 558276 | (CBA) Human IL-6 Flex Set | 100 Tests | A7 |
| IL-8 | 558277 | (CBA) Human IL-8 Flex Set | 100 Tests | A9 |
| IL-lp | 558279 | (CBA) Human IL-lp Flex Set | 100 Tests | B4 |
| MCP-1 | 558287 | (CBA) Human MCP-1 Flex Set | 100 Tests | D8 |
| FGF | 558327 | (CBA) Human basic FGF Flex Set | 100 Tests | C5 |
| VEGF | 558336 | (CBA) Human VEGF Flex Set | 100 Tests | B8 |
| TGF-pl | 560429 | (CBA) Human TGF-pi Single Plex Flex Set | 100 Tests | B6 |
3 .免疫平衡检测immune cell balance
1.Met-Flow流式检测细胞代谢
方案设计一：
本文使用了BD FACSymphony™多参数流式细胞仪，通过Met-Flow方法在单细胞、蛋白水平上同时分析了不同免疫细胞亚群代谢状态的区别。
| 指标 | 荧光素 |
| CD4 | BV480 |
| CD8 | BUV805 |
| CD3 | BB630 |
| HLA-DR | BV786 |
| CD11c | BB700 |
| CD123 | BV650 |
| IgM | BUV805 |
| IgD | BV480 |
| CD19 | BB660 |
| CD16 | BV750 |
| CD14 | PE-Cy7 |
| CD56 | PE-Cy5 |
| CD45 | BUV563 |
| PD-1 | PE |
| ILT3 | BV605 |
| CD69 | APC-H7 |
| CD86 | BUV737 |
| live-dead | BV570 |
| CCR7 | BV650 |
| CD45RA | PE |
| CD25 | PE-Cy7 |
| FOXP3 | PE-Cyanine5.5 |
| CD14 | BV570 |
方案设计二：
检测10种关键代谢蛋白；单细胞、蛋白水平；了解不同免疫细胞亚群的代谢状态
| 指标 | 荧光素 |
| SLC20A1 | AF647 |
| ACAC | BUV496 |
| HK1 | BUV661 |
| CPTIA | V450 |
| IDH2 | BB790 |
| G6PD | BUV395 |
| GLUT1 | AF488 |
| PRDX2 | BUV615 |
| ASS1 | AF700 |
| ATP5A | AF594 |
结果解读：
蛋白质水平分析显示白细胞中不同的代谢谱
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Flowjo T-SNE大数据分析；
研究小组筛选了多个代谢途径中的10种关键代谢蛋白，包括限速酶和转运蛋白。对12个供体样本流式数据根据系别标志物和代谢蛋白用BD FlowJo®进行FitSNE降维处理，解析了T、B、NK、DC及单核细胞等11种免疫细胞亚群。通过分析这11种细胞亚群中10种关键代谢蛋白表达量的差异，获取它们的代谢状态。结果发现pDC细胞表达更高水平的IDH2, ATP5A, G6PD和GLUT1，说明与mDC相比，pDC细胞的氧化磷酸化、TCA循环，PPP途径和葡萄糖摄取能力得到增强；与T细胞、NK细胞相比，B细胞表达更高水平的GLUT1和IDH2,说明B细胞摄取葡萄糖及线粒体氧化磷酸化的能力更强，这与B细胞通过mTOR信号途径活化需要充足能量有关。可见，Met-Flow可以同时检测不同免疫细胞亚群代谢蛋白的水平以获取它们的代谢状态。
2.流式细胞术对CD8+ TIL细胞的研究应用
方案设计：
原发性非小细胞肺癌(NSCLC)样本，邻近的无癌组织、血液
T-SNE 、Phenograph
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| 指标 | 荧光素 | 指标 | 荧光素 |
| CXCR5 | BV785 | HLA-DR | BUV661 |
| CCR7 | BV711 | CD4 | BUV615 |
| CXCR3 | APC | CD45RA | BUV563 |
| TIGIT | Percp-eFluor | CD69 | BUV395 |
| CD98 | BB515 | CD27 | BUV570 |
| CD73 | APC-CY7 | CD71 | PE-CY5 |
| CD25 | APC-R700 | Ki-67 | BV480 |
| TIM3 | BV650 | CD3 | BUV496 |
| CD57 | BV605 | FOXP3 | PE-CY5.5 |
| PD-1 | BV421 | T-bet | PE-CY7 |
| CB8 | BUV805 | Eomes | PE-efluor610 |
| CD95 | BUV737 | IRF4 | PE |
结果解读：
使用 (tSNE)的初始数据揭示了来自三个区域的单细胞在CD8+ T细胞剖面方面具有本质上的多样性，表明来自三个区域的单个细胞在其CD8+t细胞分布方面基本上是不同的 大数据分析图
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三个样本的单细胞在CD8+ T细胞方面具有本质上的多样性
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A、CD69通过CXCR5+Cluster15和17中的表达；
B、正常组织和肿瘤样本中CXCR5+TIM-3–CD8+T细胞的标志物表达
四、优宁维提供的产品解决方案
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Reference：
1.Zhang Y, Zhang Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 2020 Aug;17(8):807-821. doi: 10.1038/s41423-020-0488-6. Epub 2020 Jul 1. PMID: 32612154; PMCID: PMC7395159.
2.Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset
associated with improved prognosis https:/ / doi.org/10.1038/ s41591-018-0078-7
3.Pan-cancer single-cell landscape of tumor-infiltrating T cells.DOI: 10.1126/science.abe6474
4.Acta Oncol 2009;48(3):391-400. doi: 10.1080/02841860802438495.
5.Met-Flow, a strategy for single-cell metabolic analysis highlights dynamic changes in immune subpopulations. Commun Biol. 2020 Jun 12;3(1):305. doi: 10.1038/s42003-020-1027-9. PMID: 32533056; PMCID: PMC7292829.
6.High-dimensional single cell analysis identifies stem-like cytotoxic CD8+ T cells infiltrating human tumors. J Exp Med. 2018 Oct 1;215(10):2520-2535. doi: 10.1084/jem.20180684. Epub 2018 Aug 28. PMID: 30154266; PMCID: PMC6170179.
