NAFLD&NASH
一、NAFLD/NASH背景介绍
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。
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二、常见的免疫机制及热点研究目标
1、NAFLD → NASH → 纤维化机制
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肝脂毒性：脂质中间体在非脂肪组织中的积累引起肝细胞功能障碍和死亡。
Kupffer细胞的活化是肝纤维化的标志，也是炎症状态的标志。
静止的星状细胞被激活并分化为肌成纤维细胞，ECM过度沉积。
2、NASH发病机制的免疫调节
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在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）期间，肝免疫细胞库被重塑，并参与不受控制的炎症环境，促进肝损伤（肝细胞死亡）和肝纤维化，进一步加重疾病。
这些免疫细胞包括先天T细胞，如不变的自然杀伤T（iNKT）细胞、粘膜相关的不变性T（MAIT）细胞和γδ T细胞，还有传统的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞亚群，包括干扰素-γ（IFNγ）产生辅助T1（TH1）细胞、产生IL-4和/或产生IL-13的TH2细胞和产生IL-17的TH17细胞。中性粒细胞积累是NASH的早期事件，促进炎症和肝损伤，特别是通过分泌中性粒细胞细胞外陷阱（NETs）或中性粒细胞死亡时的释放（NETosis）。树突状细胞（树突状细胞）数量增加，促进肝脏炎症（CDSH期间可能通过激活CD8+ T细胞）和肝损伤。单核细胞也被迅速招募到肝脏，在那里它们可以分化为促炎巨噬细胞或产生单核细胞来源的枯否细胞。B细胞，特别是IgA+浆细胞也通过促进肝脏炎症、损伤和纤维化来促进NASH。
此外，IgA+浆细胞可以通过诱导CD8+ T细胞衰竭的免疫抑制作用，促进肝细胞癌（HCC）的进展。此外，CD4+ T细胞通过脂肪酸介导的细胞毒性作用的丢失限制了它们的抗肿瘤潜力，并有利于NASH向HCC的进展。
3、不同免疫细胞在NASH中的作用
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4、NASH期间肝巨噬细胞的多样性
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在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）期间，胚胎来源的Kupffer细胞（KCs），即健康肝脏的组织内巨噬细胞，栖息于肝窦，逐渐丢失。这些单核细胞来源的KCs表达泛巨噬细胞标记物CD64，并高水平表达CLEC1B（胚胎来源的KCs的典型标记物），但胚胎来源的其他标记物（如CLEC4F、VSIG4和TIMD4）的表达水平较低。单核细胞来源的KCs比胚胎来源的KCs更具有促炎作用，它们通过限制肝脂质储存和促进肝损伤来影响肝脏对NASH的反应，结蛋白是活化的肝星状细胞（HSCs）的标记物。这些单核细胞来源的巨噬细胞被称为脂质相关巨噬细胞，它们类似于在人类纤维化肝脏中描述的TREM2+CD9+瘢痕相关巨噬细胞。
5、肝细胞损伤相关信号通路机制
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脂肪酸会产生一些有毒的代谢物导致内质网应激、线粒体功能紊乱和氧化应激。
IL-1β、TNF-α、TGF-β1触发NF-κB、JNK和p38的激活，导致促炎细胞因子和趋化因子的释放。TGF-β1激活SMAD3信号通路和参与ROS产生的NOX4的表达。也激活TAK1-p38通路，增加促炎症介质的产生。
肝细胞的凋亡发生在caspase-3的激活、PARP的裂解和DNA的断裂。
6、肝纤维化相关信号通路机制
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肝星状细胞转分化为成纤维母细胞，具有增殖性、收缩性、炎症性和趋化性、ECM合成增加等。PDGF-β通过PDGFR引起AKT的激活，促进存活和增殖。
IL-1β/TNF-α激活JNK、NFκB，促进炎症和纤维化的产生。
TGF-β1激活SMAD信号通路，促进纤维蛋白基因的转录，肝星状细胞转分化为成纤维母细胞。TGF-β1也激活MEK通路，参与细胞增殖。
三、NAFLD/NASH常见的免疫机制及研究方法学
1、通过单细胞测序助力NAFLD/NASH转录组研究差异性靶标
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案例：
XCR1+ type 1 conventional dendritic cells driveliver pathology in non-alcoholic steatohepatitis
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NASH肝脏中过多的DC增强了肝脏引流淋巴结中的促炎性DC-T细胞相互作用，并促进T细胞的激活，特别是向1型CD8+T细胞依赖的反应。
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单细胞测序揭开了之前未被发现的cDC群体的变化
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MCDD 小鼠肝脏CD45+免疫细胞图谱
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高通量单细胞测序可以解决什么问题？
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2、炎症因子定量检测
案例：
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白细胞介素（IL）-6、IL-8、IL-10和（TNF）-α在（b）肝组织、（c）肝内淋巴细胞和（d）IHB淋巴细胞以及对照和NAFLD中的相对mRNA表达。
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（a）血浆和（b）肝匀浆中IgA、IgG1、IgG2a和IgG2b的免疫球蛋白水平
CBA：流式液相多重蛋白定量技术
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3 .免疫平衡检测immune cell balance
先天免疫和适应性免疫对NASH的影响
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案例：B细胞在NASH发病机制中的作用以及导致其在肝脏中激活的潜在机制
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通过多色流式对比不同时间段全免疫亚群水平：
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来自雄性小鼠的肝内免疫细胞无监督聚类和CD19、CD3、CD11b、F4/80、Ly6G、NK1.1和CD11c的表达，这些小鼠分别饲喂NCD或HFHC饮食15周。根据常用标记物的表达绘制gate，以区分B细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD8和CD4 T细胞、NKT细胞、NK细胞、dc和多形核中性粒细胞。
同一样本中，观察B细胞亚群比例变化：
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B2 cells ：CD3− NK1.1− CD19+ CD23+ CD5− B220hi
B1b cells ：CD3− NK1.1− CD19+ CD23− CD5− B220lo IgM+ IgD−TNFα+ B cells gated from CD3− NK1.1− CD19+ B220+ cells
四、优宁维提供的产品解决方案
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Reference：
1.Xu L, et al. Int J Mol Sci. 2019 Nov 25;20(23):5920.
2.Wang FS, et al. Hepatology. 2014 Dec;60(6):2099-108.
3.https://www.cisbio.cn/dd/by-universe/nash-fibrosis
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6.doi.org/10.1038/s41577-021-00639-3
7.doi.org/10.1038/s41575-019-0210-2
8.Role of intrahepatic B cells in non-alcoholic fatty liver diseaseby secreting pro-inflammatory cytokines and regulatingintrahepatic T' cells.
9.doi: 10.1002/hep.31755
10.Deczkowska A, et al. Nat Med. 2021 Jun;27(6):1043-1054.
