外泌体实验解决方案：外泌体标志蛋白的鉴定

承接上一篇文章，我们详细介绍了外泌体的鉴定实验解决方案，本期我们来探讨下外泌体标志蛋白的鉴定。

01 外泌体标志蛋白简介
几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前研究发现外泌体中富含核酸(microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、胆固醇等。并且不管机体正常状态或者病理状态下都能分泌多种膜蛋白和胞浆蛋白。因此，外泌体蛋白可能用于临床诊断。特别是，CD63+外泌体在黑素瘤和其它癌症病人中显著增加。因此，CD63被建议是癌症的蛋白质标志物。此外，CD81在丙型肝炎病毒进入细胞中发挥重要作用。外泌体CD81被证明在慢性丙型肝炎病人血清中显著增加，表明CD81可用于丙型肝炎病毒感染的诊断标志物。
 

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在外泌体中发现的常见蛋白包括热休克蛋白8(HSPA8)、 cd63抗原(CD63)、 β 肌动蛋白(β-ACTIN)、甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶1α (ENO1)、胞浆热休克蛋白90α (HSP90AA1)、 CD9、 CD81、酪氨酸3- 单酶/色氨酸5- 单氧化酶激活蛋白、 zeta 多肽(YWHAZ)、肌肉丙酮酸激酶(PKM2)等等。外泌体蛋白属于多种功能类群，如四跨膜蛋白tetraspanins (CD9、 CD63和 CD81)、热休克蛋白heat shock proteins（HSC70和HSC90)、膜转运蛋白membrane transporters（GTPases)和脂质结合蛋白lipid-bound proteins。
 

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通常在外泌体中识别的前100种蛋白质给大家例举如下，供大家参考。
 

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数据来源于：http://exocarta.org/exosome_markers_new

02 外泌体标志蛋白简介
目前分析外泌体蛋白的传统方法有western blot、质谱分析、扫描电镜和流式分析，主要就是利用抗体亲和性，进行western blot、免疫荧光、免疫组化、流式实验，其中又以Western Blot和流式细胞术为主。

2.1 Western Blot实验鉴定外泌体蛋白
实验流程：外泌体蛋白提取→marker选择→Western blot实验和结果
外泌体蛋白提取：小优之前文章介绍的外泌体提取方法，获得外泌体蛋白，用BCA法测定exosome蛋白浓度，然后进行了WB实验
marker选择：结合文献，寻找合适的marker，设置阳性对照和阴性对照。比如细胞的CD63和外泌体的CD63都可以杂到，会再在细胞杂一个比如内质网的marker蛋白，但是外泌体杂不出来阳性对照；比如常用marker：CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101、Calnexin。其中calnexin就是一个阴性对照，全细胞有而外泌体无，其他都是阳性对照，即全细胞和外泌体均有的。另外在选择外泌体的阳性指标的时候，一般建议2-3个指标验证以确保结果的准确性。
Western blot实验和结果：与常规WB操作相同。
 

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The exosomes were isolated from the conditioned medium of cultured primary rat cortical neurons. Both Alix and CD63 are exosomal markers, and Calnexin is an endoplasmic reticulum marker.  来源文献：Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity.Cell Res. 2017 Jul;27(7):882-897. doi: 10.1038/cr.2017.62. Epub 2017 Apr 21.
一般情况下，如下表第一组或者第二组至少2-3种蛋白存在，第3组蛋白不存在。透射电镜/原子力显微镜观察形态，测量大小，就可以鉴定是否为外泌体。
 

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2.2 流式实验鉴定外泌体蛋白
不同来源的外泌体会带有特定的表面分子marker，但是由于有些外泌体的直径太小（40-100nm）,很难通过标准的流式检测方法对其进行分析。为此，美天旎研发了一款试剂盒MACSPlex Exosome Kit, human，用于简单、快速的分析外泌体表面37种潜在蛋白。
 

MACSPlex Exosome Kit原理和步骤示意图

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MACSPlex Exosome Kit原理和步骤：
1、MACSPlex Exosome Kit含有耦联39种抗体的捕获微球，其中2种同型对照抗体，因此可以一次检测37种潜在的蛋白marker。外泌体与捕获微球共孵育后，表达不同表面抗原的外泌体被含相应抗体的捕获微球识别并结合，进而形成捕获微球-外泌体复合物。
2、MACSPlex Exosome Kit还包含荧光素标记的检测试剂，包括常见的三种外泌体marker，CD9、CD63、CD81。根据表面抗原不同，检测试剂识别并结合到捕获微球-外泌体复合物上，形成带有荧光标记的捕获微球-外泌体-CD9/63/81检测试剂复合物，即可通过荧光强度进行流式检测。  
 

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利用MACSPlex Exosome Kit对黑色素瘤细胞和结肠癌细胞中的外泌体进行分析结果图。
 

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不同来源的外泌体表达的肿瘤抗原标记明显不同。利用MACSPlex Exosome Kit对黑色素瘤细胞和结肠癌细胞中的外泌体进行分析。黑色素瘤来源的外泌体都是MSCP+的，但却几乎不表达CD326。同时，流式分析可见，不同肿瘤来源的外泌体表达的抗原标记也是明显不同的。

3.小结
外泌体标志蛋白标志物的鉴定就为大家介绍到这，后续我们将继续为大家提供更多外泌体分子生物学技术，欢迎持续关注我们
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