32.4分 | 银屑病重要致病机制的揭示

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甲氨蝶呤通过抑制多肽转运体SLC46A2活性抑制银屑病皮肤炎症

背景部分介绍：

细胞质先天免疫受体通过感知进入细胞内部的微生物产物并激活有效的免疫和炎症反应，在宿主防御中发挥关键作用。这些受体包括几种核酸感受器，如cGAS、RIG-I、NLRP1和AIM2，以及其他对细菌产物(NOD1、NOD2、NAIPs和NLRC4)或危险信号(NLRP1或3)作出反应的受体。在某些细胞类型中，这些细胞质传感器的配体可以进入到细胞质中。例如，细菌细胞壁的片段或多肽进入细胞质并通过激活NOD1或NOD2和NF-κB来驱动有效的炎症反应。含有二氨基戊酸(DAP)的多肽，是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性杆菌常见的，是有效的NOD1激动剂，而从几乎所有细菌肽聚糖中提取的多肽二肽(MDP)可以激活NOD2。

虽然多肽可以进入某些细胞类型，但其进入的潜在机制尚不清楚。最近作者发现SLC46家族是果蝇和哺乳动物细胞中的候选多肽转运体。特别是，人类或小鼠SLC46A2或SLC46A3，而不是SLC46A1(编码质子偶联叶酸转运蛋白)，在细胞系中强烈增强多肽触发的NOD依赖性NF-κB报告细胞活性。SLC46A2在促进含有DAP的多肽气管细胞毒素(TCT)激活细胞质先天免疫受体NOD1方面非常有效；Slc46a2主要表达于皮肤表皮和胸腺皮质上皮细胞。NOD介导的细菌识别在肠道微生物群与肠上皮之间的相互作用中起着关键作用。然而，对NOD受体在其他屏障组织(如皮肤)中的作用知之甚少。与肠道微生物组相似，皮肤微生物组不断与表皮相互作用，调节局部和全身免疫反应，并与炎性皮肤病(如牛皮癣)有关。然而，NOD1/2感知在该组织中的作用尚未得到评估。

虽然在NF-κB报告基因检测中SLC46A1对NOD1或NOD2多肽的感知影响不大，但它是叶酸和抗叶酸的转运蛋白。抗叶酸甲氨蝶呤(MTX)是一种用于治疗血癌的抗增殖剂，也是一种有效的抗炎药，通常用作牛皮癣、类风湿关节炎和其他免疫介导的炎症性疾病的一线治疗。然而，MTX的抗炎作用机制尚不清楚，与其抗增殖活性无关。SLC46A2或SLC46A3与SLC46A1的相似性30%左右，在MTX吸收中的作用尚未得到广泛研究。

在这里，作者描述了Slc46a2缺失的小鼠，证明了Slc46a2在角化细胞中传递DAP-muropeptide和NOD1激活的基本功能，并鉴定了DAP-muropeptide引发的表皮炎症反应。这种反应涉及caspase-1-和gasdermin-D依赖性表皮角质形成细胞的质膜通透性和IL-1α的释放。具体要点如下图：

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主要结果部分

Slc46a2与NOD1刺激的中性粒细胞募集

Keratinocyte 通过Slc46a2和Nod1响应DAP-muropeptides

DAP-muropeptides转运需要Slc46a2（甲氨蝶呤MTX抑制）

在Slc46(1/2/3)对DAP-muropeptides的转运

Slc46a2-/-和Nod1-/-小鼠对银屑病炎症的抗性

首先，为了方便大家更清晰的明了文章结构及所用实验方法，理解作者的思路，小优博士对文章做了相关整理并制作了流程图（如下），供大家参考：

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结果具体介绍

01Slc46a2是小鼠腹膜和皮肤对NOD1刺激的中性粒细胞募集所必需的

（小背景介绍：

Pycard编码焦亡相关斑点样蛋白（ASC）是炎性小体中连接胞浆内受体和半胱天冬酶-1的接头蛋白，在炎性小体活化中ASC聚集成大分子的二聚体；Myd88编码胞质衔接蛋白，其在先天性和适应性免疫应答中起关键作用。在白介素1和Toll样受体信号转导通路中起着至关重要的信号转导作用。）

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首先为了验证Slc46a2/3及NOD1/2的作用及信号通路传递组合，作者分别构建了四种基因的敲除体，分别用iE-DAP和MDP进行腹膜下及皮下注射，最终验证了下面的信号通路：Slc46a2通过iE-DAP激活Nod1募集了中性粒细胞，而Slc46a3通过MDP激活Nod2募集中性粒细胞A-E。接下来，为了进一步研究下游通路，又分别构建了Slc46a2及Mydd88, Pycard的缺失小鼠，发现Slc46a2通过iE-DAP激活Nod1释放IL-1a募集中性粒细胞F-H。总结如下：

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02小鼠表皮角化细胞通过Slc46a2和Nod1响应DAP-muropeptides

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为了验证小鼠角化细胞在银屑病及验证过程中的作用，将表达Slc46a2和Nod1的角化细胞进行体外培养，经DAP-muropeptides刺激，进行IL-1α表达的检测，中性粒细胞的募集，细胞损伤及下游信号通路检测等（相关描述图中注释）。最终得出如下结论：

Slc46a2和Nod1刺激后共同促进IL-1α的表达及中性粒细胞的募集

Slc46a2、Nod1、RIPK2感染后在细胞损伤中有重要作用

Casp1及焦亡-like 过程参与感染涉及的角化细胞死亡

03DAP-muropeptides转运需要Slc46a2，并被甲氨蝶呤(MTX)阻断

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为了直接评价SLC46A2在dap多肽转运中的作用，采用了两种互补的化学生物学方法。首先，合成了一种经过修饰的、具有生物活性的iE-DAP炔衍生物，并利用“click-chemistry”技术可视化该多肽被角化细胞吸收的过程。发现在处理60分钟后，只有slc46a2缺陷角化细胞中不能检测到信号，且MTX以剂量依赖的方式抑制感染触发的角化细胞通透性。

04在slc46转染的细胞中，抗叶酸制剂不同程度地抑制iE-DAP的转运

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接下来进一步表征slc46介导的DAP-muropeptides转运，在细胞中分别过表达Slc46a1、Slc46a2或Slc46a3。Slc46a2的表达使iE-DAP的细胞传递强于其它slc46，且发现MTX显著阻断了表达slc46a2的细胞中iE-DAP的吸收。接着进一步分析了叶酸和抗叶酸对多肽转运的影响。培美曲塞(PTX)，另一种用于癌症治疗的抗叶酸药物，显著但不完全干扰slc46a2支持的iE-DAP转运，但没有影响(甚至增加)slc46a3介导的iE-DAP摄取；叶酸(FA)阻断了SLC46A2介导的iE-DAP转运，而SLC46A3不阻断；MDP对SLC46A3介导的iE-DAP转运的竞争强于SLC46A2介导的转运，这与SLC46A3对MDP的选择性一致。这些结果也表明了SLC46A2和SLC46A3宜分别作为iE-DAP或MDP的载体。

05Slc46a2-/-和Nod1-/-小鼠对IMQ (咪喹莫特)诱导的银屑病炎症具有抗性

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最后，作者使用IMQ模型来探讨Slc46a2和Nod1在银屑病样炎症中的作用。局部应用IMQ 7天后，WT小鼠表现出预期的银屑病样炎症，而Slc46a2和Nod1缺陷小鼠明显耐药A-B。IMQ处理3天，然后局部应用C. accolens，类似地在WT小鼠中引起银屑病样炎症，而Slc46a2和Nod1缺乏的动物均表现出减轻的炎症C。此外，局部应用MTX可以减轻WT小鼠的银屑病样炎症D。这些结果表明，SLC46A2是IMQ小鼠模型银屑病炎症进展所必需的，通过运输细菌来源的DAP-muropeptides并激活NOD1信号，而MTX通过干扰SLC46A2-NOD1反应来抑制这种银屑病炎症。

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