分离蛋白纯化现在已经是研究者用于研究蛋白必不可少的手段，但是在前期的蛋白表达过程中难免会得到包涵体蛋白，如果想要让蛋白有活性，那必须要进行包涵体复性，然而蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，因此很多老师对包涵体变性、复性、纯化也束手无策。
遇到问题不要怕，今天小优来给大家介绍一下包涵体的纯化策略~
什么是包涵体？
包涵体(Inclusion Body)是外源基因在原核细胞中表达，尤其是在大肠杆菌中高水平表达，在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，可溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体形成的原因
包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或所处的环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
容易导致包涵体形成的原因有：
01蛋白表达过高、合成速度过快
蛋白在高水平表达的情况下，合成速度较快，导致蛋白没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，导致蛋白质无法达到足够的溶解度。
02蛋白的氨基酸组成
一般含硫氨基酸越多，越容易形成包涵体，另外，脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关
03蛋白所处的环境
发酵温度较高，或者是蛋白所处的溶液pH接近蛋白的等电点，都比较容易形成包涵体。
04蛋白异源性
对于大肠杆菌表达体系而言，重组蛋白作为大肠杆菌的异源蛋白，由于大肠杆菌缺乏一些真核蛋白翻译后修饰所需酶类，使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。对此，有人通过共表达分子伴侣的方法来增加可溶蛋白的比例。
如何避免包涵体？
对于包涵体蛋白的表达和纯化，困扰着很多老师，因此去尽量避免包涵体的形成也非常重要。
01延缓蛋白的表达
可以降低IPTG（0.01-0.1mM）浓度或者降低诱导温度并延长诱导时间来延缓蛋白的表达，或者构建质粒时采用较弱的启动子。
02更换标签
可以使用GST、MBP等标签来增强蛋白的可溶性。
包涵体的纯化步骤
包涵体的纯化步骤包括样本破碎、洗涤、溶解、复性、纯化以及鉴定6个步骤：
01样本破碎
细胞破碎方法包括：超声处理、高速组织捣碎、玻璃匀浆、反复冻融、化学处理等方法，具体需要根据自己的样本来来选择合适的方法。
02洗涤
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。所以需要洗涤，一般用低浓度的盐酸胍和尿素或者中性去垢剂来洗涤，为提高洗涤强度也可以在去垢剂里加50mM的NaCl来增强洗涤效果。
03溶解
包涵体的溶解一般用变性剂，如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。另外有些包涵体蛋白中所含二硫键较多，因此还需要加入巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）等还原剂促溶。
04复性
如果研究包涵体蛋白的功能活性，那么复性也是非常重要的步骤，复性一般用透析、超滤、柱上复性三种方式。
05复性
利用柱上复性的方法，在这个过程中就可以完成纯化，包括凝胶过滤、亲和和离子层析的方法。
小优在这里以一篇高分文献为例，给大家梳理包涵体的纯化具体步骤。
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线粒体醛脱氢酶2 (ALDH2)主要与酒精代谢第二阶段的乙醛解毒有关。为了深入研究ALDH2的功能，需要更高的纯度和均匀的蛋白质组成。本研究利用His和一个小的泛素相关修饰物融合标签构建了一个高效的表达ALDH2的大肠杆菌系统。重组ALDH2s以包涵体的形式表达。富集ALDH2的包涵体用6 M盐酸胍变性，然后超滤ALDH2。最后，通过亲和层析和凝胶过滤层析纯化了ALDH2。本研究首次报道了pET-SUMO-ALDH2重组质粒在大肠杆菌中的表达，并对其包涵体进行了分离和折叠。纯化后的ALDH2具有较高的纯度、产率和生物活性。
01ALDH2重组质粒的构建和表达鉴定
通过利用基因工程方法成功构建了pET-28a(+)-ALDH2、pET-32a(+)-ALDH2和pET-SUMO-ALDH2重组质粒。在三个重组质粒中，根据总蛋白表达，pET-SUMO-ALDH2是我们的最佳选择(图1A)。
图1.重组ALDH2质粒在细菌表达系统中的表达鉴定
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02探索ALDH2的最佳表达条件
通过SDS-PAGE电泳分析温度、IPTG浓度、孵育时间、摇床转速等4个最常研究的参数对ALDH2重组蛋白表达的影响。结果表明，在37°C和100 rpm下，0.3 mM IPTG诱导10 h后，在ALDH2的不溶部分产生了最大的重组蛋白。在16°C和70 rpm下，0.3 mM IPTG诱导12 h后，获得了ALDH2的最大可溶部分(图2A−D)。
图2.探索重组ALDH2蛋白的最佳表达条件。
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03ALDH2的变性、复性和纯化
（1）细菌破碎：细胞10000 g离心15 min, PBS洗涤2次，重悬于40 mL裂解缓冲液(20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl, 10 mM咪唑，pH 7.4)中。溶菌酶(1 mg/mL)和脱氧核糖核酸酶I (20 μg/ mg)在冰浴中加入30 min，并在300 W的频率下，以5 ~ 7 s的脉冲间隔，用超声仪连续均匀超声16 min。裂解液在4°C下，12,000g离心10分钟，沉淀部分即为ALDH2包涵体。
（2）洗涤：得到的包涵体部分用缓冲液(0.5% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA，和10 mM DTT)洗涤两次，通过在4°C下离心12,000g 15分钟去除污染物可溶性蛋白。
（3）溶解：洗涤的包涵体在50 mL缓冲液(50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA和10 mM DTT)中重悬，并使用超声波连续均质6分钟。重悬的包涵体的每个部分在新制备的变性缓冲液中溶解（6 M Gua-HCl, 10%甘油，50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl，10 mM EDTA, and 10 mM DTT）。
（4）复性：在4℃下向包涵体中滴加变性剂缓冲液( 100 m M Tris pH 8.0 , 400 m M L -精氨酸, 2 m M EDTA)，每毫升的复性时间为8 h。经超滤浓缩缓冲液交换步骤后，在4℃下10000g离心30 min，去除去垢剂。
（5）纯化：据蛋白质量将Ulp1（用于切割sumo标签）加入到复性后的总蛋白中，然后在16 ℃下孵育释放ALDH2。通过亲和和凝胶过滤层析纯化得到蛋白。
图3.ALDH2的复性与纯化
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04ALDH2的活性检测
（6）本研究使用高效液相色谱法检测ALDH2活性。不添加ALDH2时，2-羟基-3硝基苯甲醛(2H3N-BA)在UV 280 nm处的吸光度为632 mAU(图6A);在89 pmol/L后，ALDH2加入到反应体系中，吸光度降至344 mAU(图6B)，因此可以确定我们纯化的ALDH2具有生物活性。
图4 ALDH2活性检测
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希望大家阅读了此文章，可以对包涵体的纯化有一定的思路。
