外泌体（Exosomes），一种40-160nm的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），来源于多囊泡体（MVB）。多囊泡体与质膜融合后，外泌体被释放到细胞外。外泌体运输蛋白质、脂质、核酸和糖，在细胞间通讯中发挥重要作用。
图1 细胞外囊泡
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自2013年外泌体领域科学家获得诺贝尔生理或医学奖，外泌体在各个领域的作用都被深入研究。癌症、心血管、免疫学、体外诊断，随处可见外泌体身影，它在美容行业的应用也不可小觑。
小优给大家推荐过许多外泌体提取方法和试剂、外泌体miRNA知识。想必超速离心、密度梯度离心、沉淀法、膜亲和法、免疫磁珠、分子排阻、超滤这些提取方法大家都十分了解。
这次来讲一下外泌体的鉴定过程中，WB实验的注意事项和结果判断吧。
我们知道，外泌体表面蛋白包括四萜类、整合素、免疫调节蛋白等，CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神经酰胺等常用作外泌体标记的蛋白质。不过，在不同细胞中，它们的含量和表现也不尽相同。那么，在实际的实验中，它们的结果都是怎样的呢？
图2 外泌体标志物
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Tsg101
Tsg101最初作为肿瘤抑制因子和负生长调节剂被研究者发现，是转运所需的内体分选复合体（ESCRT-I）的关键成分，参与多囊泡体的生物发生、外泌体分泌。因此被定为外泌体的标志物之一。
图3 外泌体与全细胞裂解液中TSG101、ALIX蛋白表达情况
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CD9、CD63和CD81
CD9、CD63和CD81属于四萜类化合物，其特征是四个跨膜结构域和两个细胞外结构域中最大的一个结构域中的特定折叠。所有细胞类型和组织都表达四萜蛋白的可变组合，其中一些主要存在于质膜上，如CD9；有些则存在于细胞内，如CD63。这类蛋白被认为是外泌体的特异性标记。然而，有文献报道，这些蛋白质现在也已在凋亡小体和微泡中观察到。
研究人员用MCF细胞做了实验，分析了它们在EVs中的相对富集，即它们在EVs中相对于其细胞表达水平的比例。CD63的富集度比CD9低3倍，CD81的富集度平均比CD9高约2倍。与CD63相比，CD9和CD81主要定位在质膜上，细胞内定位很少。
图4 CD9、CD63和CD81在相同细胞的表达情况对比
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Calnexin
Calnexin是一种I型整合内质网膜蛋白，通常位于内质网和胞质溶胶之间。Calnexin阴性被看作获得较纯的外泌体的条件之一。
我们经常会看到这样的报道。CD63和CD81在OM-MSC外泌体中组成性表达，并且在外泌体部分中更丰富。在OM MSC衍生的外泌体中未检测到阴性外泌体标记物calnexin。
图5 外泌体中calnexin阴性
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但也有例外。
WB结果显示，外泌体标记蛋白CD63和TSGl01在EMS（子宫内膜异位症）外泌体和NHS（正常人样本）外泌体中均大量表达。在NHS外泌体中未检测到阴性标记蛋白Calnexin。在EMS外泌体中检测到少量Calnexin。而我们可以看到，CD63在不同样本中条带位置也有细微的差异。
图6 EMS的外泌体检测到Calnexin
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GM130
GM130是一种高尔基体骨架蛋白，与高尔基体膜紧密结合。研究者提取MSC外泌体，发现ALIX和CD63存在于EM中。而细胞色素c、GM130和calnexin在细胞裂解物中得到证实，但在EM中没有。
图7 MSC的外泌体标志物
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以上就是用WB鉴定外泌体中最常检测的指标了，大家可要注意下面这些点呀。
01选择合适的阴阳标志物作为对照
例如：检测Tsg101、CD9、CD63、CD81其中2-3个；Calnexin、GM130其中1个，确定外泌体的浓度和纯度。
02与全细胞裂解物做对比
Tsg101、CD9、CD63、CD81这些蛋白也存在于其它细胞膜或细胞质，但与外泌体中的含量有差异。通过对比，不仅可以鉴定外泌体，也可以发现这些指标在发生病变的细胞中的变化。
03条带位置判断
对比发现，即使来源相同细胞的细胞器和外泌体，检测到的Tsg101、CD63等指标的表观分子量也有所不同。尤其对于CD9、CD63、CD81这些膜蛋白，要放多裁一点膜来观察它们是否发生糖基化条带上移。
参考文献：
María Yáñez-Mó，Pia R.-M. Siljander，Zoraida Andreu et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles（2015）4：27066.
Raghu Kalluri， Valerie S. LeBleu. The biology, function, and biomedical applications of exosomes (2020) 367(6478): eaau6977.
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| 产品名称 | 货号 |
| Exosomal Marker Antibody Sampler Kit | 74220 |
