【小优细节君】焦亡研究之GSDMD检测经验分享

细胞焦亡是一种促炎性的细胞程序性死亡方式，通过对细胞焦亡的研究，有利于了解相关的感染性疾病，代谢性疾病等发病机理，并为治愈这些疾病提供新的思路。之前小优细节君为大家介绍过焦亡相关的caspase-1和NLRP3蛋白检测小tips，然而在焦亡通路中行使打孔功能的关键蛋白- Gasdermin D在检测时也时常会出现无条带，多杂带等让人头痛不已的情况，今天，小优细节君就带大家一起来看一看WB实验中GSDMD检测难题的解决方案。

GSDMD的前世今生

在讨论实验方案之前，我们先来回顾下GSDMD的前世今生。GSDMD属于Gasdermin（GSDM）蛋白家族，除GSDMD外，还包含 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME/DNFA5 和 PVJK/GSDMF 蛋白，是一组结构相关的新型蛋白质。GSDM家族被认为与免疫反应相关的孔形成有关。具有 C 端抑制结构域、细胞毒性的N 端结构域和柔性连接结构域（GSDMF 除外）。其中，GSDM-N端结构域可被剪切并释放出来，在细胞膜上形成大的寡聚孔，从而促进细胞的分解。[1]

Fig.1 Gasdermin家族成员
△点击放大图片

目前的研究表明，GSDMs 参与调控各种生理和病理过程，如细胞分化、凝血、炎症和肿瘤发生。蛋白 GSDME 和 GSDMA 也与自身免疫性疾病和某些癌症有关。大多数 GSDMs蛋白被认为具有形成孔隙的能力。其中研究最深入的成员GSDMD蛋白已被确认为细胞焦亡的执行者[2]。焦亡是一种溶解性细胞死亡的炎症形式，它是在形成 caspase-1 激活的炎症体后诱发的。其特点是一种由 GSDM家族蛋白介导，激活 NOD 样受体蛋白 3（NLRP3）炎性体，形成细胞膜孔，释放 IL-1β 和 IL-18 [3,4]。然后由促炎性Caspases通过经典和非经典炎性体信号通路裂解的GSDMD蛋白生成GSDMD-N末端结构域（GSDMD-N），再由GSDMD-N迅速插入质膜形成活性孔[5,6]。因此，GSDMD-N 充当了细胞焦亡的最终执行者。

Fig.2 GSDMD在焦亡中的作用方式
△点击放大图片

实验细节

由于 GSDMD在细胞焦亡和自身免疫性疾病的炎症中有可能存在作为驱动因素的潜力，是一个极具吸引力的药物靶点，GSDMD成为目前研究的热点之一。今天小优细节君就来和大家一分享一下，WB实验中，检测GSDMD的一些小经验。

在WB实验中，最常遇到的问题莫过于无条带和有杂带这两大类，下面我们展开说说。

01实验结果无GSDMD条带或信号很弱

GSDMD存在多种蛋白形式，包括约53 kDa附近的GSDMD前体、约31kDa的剪切体GSDMD-N、约22 kDa的剪切体GSDMD-C等，在多数的情况下无需药物处理即可在样本中检测到GSDMD前体蛋白，虽然GSDMD在不同的样本中广泛表达，但由于表达水平可能有差异或者受到一些处理方式的影响，在检测时也会有可能出现无条带或信号弱的情况。这时我们可以先确定一下样本的表达水平，通过查询数据库、文献，或者进行qPCR实验作为参考。

相比较全长GSDMD蛋白的检测，GSDMD-N的检测难度则更大一些。从前文的介绍中，我们不难发现，GSDMD的打孔功能主要是由N-端结构域执行的，而GSDMD-N需要经过Caspases剪切产生,因此具有活性的GSDMD-N片段通常需要适当的诱导才能产生。下图展示了未处理的小鼠BMDM和经LPS和Nigericin处理后的小鼠BMDM样本中，GSDMD-N的检测情况。可以看到在未处理或仅经LPS处理的样本中，无法检出GSDMD-N条带，而在不同浓度Nigericin的处理下GSDMD-N条带信号强度也有变化。

Fig.3 不同诱导处理对GSDMD-N的影响（图源CST官网）
△点击放大图片

结合以上结果，我们在进行诱导处理时，可以留意观察一下一些表观变化，以期能检出理想的信号条带。在诱导处理时，如果可以通过肉眼观察到细胞死亡，并且镜检时能观察到细胞涨大，胞质泄露等经典的细胞焦亡形态特征，则更有可能检测到GSDMD-N条带。另外细胞在发生焦亡时，贴壁性会降低，可能导致部分细胞在洗涤后丢失。建议离心收集细胞培养液中的脱落细胞，并使用PBS将培养板上的细胞全部刮出离心后，一起裂解。

在判断诱导条件干扰时，还有一个小方法，即，如果使用的一抗是可以同时识别全长和剪切体GSDMD的，那么可以看下结果中53KD附近的全长条带是否正常。如全长蛋白正常显影，而30KD附近无信号，则可以推断诱导条件需要适当调整。

而更直接的排查方法，是使用阳性样本设置对照组，进行平行实验，这样不仅能排查样本自身方面的干扰项，还能同步排查实验中的操作和试剂干扰，高效的解决实验问题。

02杂带干扰影响结果判读

出现杂带的时候，我们首先要判断一下这些杂带是否为靶标条带相关，如条带的信号强度符合诱导处理的变化趋势，则有可能是蛋白降解或者一抗为多克隆抗体引入的干扰，可以更换新鲜制备的样本和单抗进行实验。并且如果检测样本为组织样本，成分比细胞样本会更加复杂，也可能会引入杂带干扰。如果想要进一步确定条带的特异性，还可以通过更换样本、设置阴性对照以及设计敲除实验进行验证。

Fig.4 全长GSDMD杂带干扰
△点击放大图片

另外，如果靶标蛋白的表达量较低，需要经长时间曝光显影也有可能会导致杂带和高背景的情况出现。

值得一提的是，在检测剪切体GSDMD-N/C时，建议同时检测全长前体蛋白以便更准确的判断变化趋势，作进一步的分析。

部分相关产品：

 

参考文献：

[1] The Versatile Gasdermin Family: Their Function and Roles in Diseases

[2] Gasdermins and their role in immunity and inflammation

[3] Shi J, et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 2015;526(7575):660–665. doi: 10.1038/nature15514. - DOI - PubMed

[4] Kuang S, et al. Structure insight of GSDMD reveals the basis of GSDMD autoinhibition in cell pyroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(40):10642–10647. doi: 10.1073/pnas.1708194114. - DOI - PMC – PubMed

[5] Xu B, et al. Gasdermin D plays a key role as a pyroptosis executor of non-alcoholic steatohepatitis in humans and mice. J Hepatol. 2018;68(4):773–782. doi: 10.1016/j.jhep.2017.11.040. - DOI - PubMed

[6] De Vasconcelos NM, et al. Single-cell analysis of pyroptosis dynamics reveals conserved GSDMD-mediated subcellular events that precede plasma membrane rupture. Cell Death Differ. 2019;26(1):146–161. doi: 10.1038/s41418-018-0106-7. - DOI - PMC - PubMed