【小优细节君】STING，固有免疫的热门靶点有何神秘之处？

STING

作为固有免疫信号通路的关键蛋白，STING广泛表达于多种组织。STING的免疫调节作用使其成为肿瘤免疫治疗领域的明星靶点，已在免疫学和病理学领域的研究取得了重要进展。

大家在检测STING蛋白时是不是也会得到与预期不符的结果呢？本篇文章总结了一些要点和大家一起探讨，请和小优细节君一起学习吧~

STING

干扰素基因刺激物(Stimulator of Interferon Genes，STING)通过与细胞内DNA结合，并在胞内形成二聚体，从而激活下游信号通路，引发免疫细胞产生干扰素和其他免疫调节分子，以应对病毒感染和其他病理状态。

STING蛋白主要以对称二聚体形式存在于内质网膜上。下图以人 STING(hSTING) 蛋白为例，全长由C末端结构域(CTD)和跨膜结构域(TM)组成。CTD由配体结合域(LBD)或C末端尾部(CBD)和C末端尾部(CTT)组成，通常负责结合、蛋白质相互作用和信号转导。TM结构域，也称为N-末端区域，它在物种间是保守的，具有重要的内质网膜支持作用。

 图1 hSTING功能域示意图
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cGAS-STING信号通路

cGAS-STING信号通路是一种经典且重要的机体免疫应答途径。 

图2 cGAS-STING信号通路
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cGAS（Cyclic GMP-AMP Synthase）是一种DNA感应的酶，它与来自死细胞、病毒和细菌的DNA相互作用，在ATP和GTP存在的情况下催化合成二聚体的cGAMP（cyclic GMP-AMP），后者和细菌来源的环二核苷酸（CDNs）都可诱导STING的激活。

STING被激活后，从内质网转移到高尔基体，在高尔基体区激活了TBK1和IKK，分别使IRF3和IκBα（NF-κB的抑制物）磷酸化。然后IRF3和IκBα二聚体进入细胞核，触发了促炎症细胞因子的转录和翻译，如I型IFN、TNF和IL6，这些细胞因子可以参与抗病毒免疫应答和自身免疫调控。

以上介绍了这么多STING，怎么样才能在WB检测中获得理想的条带呢？

01确认好的研究对象

虽然STING广泛表达于多种组织类型，包括免疫细胞和非免疫细胞来源，但不代表每种细胞/组织都能检测到STING的表达。因此，在选择某种特定样本进行探究实验时，最好先查阅文献和数据库看看是否有足够的表达量，也可以同时使用表达量高的细胞样本或者组织作为阳性对照来进行实验。THP-1细胞是经典的cGAS-STING信号通路的工具细胞。

图3 THE HUMAN PROTEIN ATLAS中STING在各种细胞系的表达量
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图4 STING (D2P2F) Rabbit mAb #13647 产品例图
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02制样时要超声

如果样本中STING的表达量不高，裂解细胞/组织时加以超声，有助于断裂染色质，同时增加蛋白的可溶性，使抗原表位充分暴露出来，与抗体结合更容易。

超声的方法也比较简单，细胞或组织裂解后，置于冰上，超声条件是10-15s，3 次(期间每次间隔10s)，超声频率是30%－40%，电流30A; 如果没有超声仪，可以采用1ml 带针头的注射器冰上反复抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸为止。

03磷酸化检测

外来核酸（如病毒DNA或细菌DNA）是STING信号通路激活的常见来源之一。当然，细胞发生自发性的DNA损伤或某些细胞内代谢异常时，也会导致细胞内DNA的释放，从而激活STING。

在研究过程中应该采用适当的处理条件，如使用合适的激活剂（如cGAMP和DNA）以激活STING蛋白。此外，细胞的处理时间和剂量也需要进行优化，以确保适当的磷酸化水平。

 

要知道STING信号通路的蛋白表达情况在不同的细胞系中差距非常大，同样的刺激方法在某些细胞中可以得到阳性结果，换一个细胞系可能就不可行了。文献中比较常见的工具细胞是RAW264.7细胞和小鼠骨髓源性的巨噬细胞。

CST推荐使用5 μg/mL poly(dA:dT)转染3小时的条件处理细胞以获得磷酸化STING的对照样品。下图为CST科学家使用同样的刺激方法对不同表达STING的细胞系进行刺激，然后检测磷酸化STING的结果。可以看到即使同样是STING高表达的细胞，在poly(dA:dT)刺激下，STING的磷酸化水平也是不一样的。

图5 相同刺激方法在不同细胞中的作用效果
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还有一点很容易被大家忽略：STING在磷酸化之后会出现条带分子量上调的情况。在转膜时就需要将膜留的宽一些，避免目的信号被裁去。

STING磷酸化上下游通路涉及到TBK1、IRF3、NF-κB等多个信号分子，相关靶标的结果 也可以作为STING磷酸化表达的参考依据。

04其他翻译后修饰

除磷酸化外，STING还存在多种类型的翻译后修饰，包括多泛素化、SUMO化、棕榈酰化、硝基烷基化、氧化、羰基化和二硫键形成。这些修饰对STING的活化发挥了重要的调节作用，如K48-多聚泛素化主要促进STING经蛋白酶体途径的降解；K63-多聚泛素化可以促进STING活化复合体的形成等。

下表详细展示了STING翻译后修饰的功能，大家在选择研究方向和检测位点时都可以参考~

图6 STING 翻译后修饰
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以上是小优细节君总结的一些关于STING的WB检测Tips，当您一直重复实验得不到理想结果时可以根据上述建议进行调整尝试，可能一个小细节的改变就可以帮您得到理想的实验结果。

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参考文献：

1.Chen, Qi et al. “Regulation and function of the cGAS-STING pathway of cytosolic DNA sensing.” Nature immunology vol. 17,10 (2016): 1142-9. doi:10.1038/ni.3558

2.Decout, Alexiane et al. “The cGAS-STING pathway as a therapeutic target in inflammatory diseases.” Nature reviews. Immunology vol. 21,9 (2021): 548-569. doi:10.1038/s41577-021-00524-z

3.Zhang, Zili et al. “Multifaceted functions of STING in human health and disease: from molecular mechanism to targeted strategy.” Signal transduction and targeted therapy vol. 7,1 394. 23 Dec. 2022, doi:10.1038/s41392-022-01252-z

4.https://www.proteinatlas.org/ENSG00000184584-STING1