Cell | 自闭症基因如何从多层面扰乱椎体神经元

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锥体神经元形成活跃的、短暂的、多层的回路，在新皮层开始时受到自闭症相关突变的干扰

背景部分介绍：

新皮层包含高度互联的神经元回路，其中最常见的一类神经元，锥体神经元(PN)，其大部分连接来自其他PN。PN有不同的类型，具有不同的转录组特征，并被组织成不同的层。虽然已经深入研究了PN- PN回路的活性和交流，但在体内，在成人中，第一个活性PN回路何时以及如何在体内组装尚不清楚。此外，由于神经发育障碍与皮层回路的缺陷有关，对锥体电路形成的洞察也可能与理解自闭症谱系障碍等疾病的机制有关。

在皮层发育过程中，PNs迁移到它们在新皮层的最终位置，并以inside-out的方式形成层。填充第5层和第6层的椎体神经元 (L5-PNs和L6-PNs)首先生成。在小鼠中，这些神经元出现在胚胎期(E) 11.5和E14.5，并从E12.5开始迁移到发育中的皮层。神经元活动始于胚胎发育。Cajal-Retzius细胞早在E14.5天，PNs在E15.5天开始，在体内的体细胞中出现钙瞬变。此外，在E14.5时，丘脑神经元在体外表现出相关活动，当丘脑轴突到达皮层时，这种相关活动可在E16.5到达皮层。然而，皮层PNs在体内首次与其他皮层PNs组装成回路的时间，以及这些回路中活动出现并变得相关的时间仍不清楚。

在自闭症谱系障碍和精神分裂症等神经发育障碍的背景下，了解第一个活跃PN回路的时间和组装很重要。事实上，常见的电路功能障碍已经被假设为与这些神经发育障碍相关的遗传异常异质混合物的表型相似性的基础。此外，在自闭症儿童和自闭症小鼠模型的大脑中，大约在出生时，已经观察到有组织紊乱的皮质组织斑块。然而，在胚胎发育过程中，自闭症相关基因的突变是否会干扰PN-to-PN回路的发育尚不清楚。

本文主要通过scRNA-seq、膜片钳、双光子显微镜观察等技术来分析锥体神经元细胞组成、活性功能及自闭症基因扰乱的相关研究，模式图及要点如下。

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主要结果部分

Rbp4-Cre神经元具属于L5-PN（胚胎期PNs简称为Rbp4-Cre 神经元）

Rbp4-Cre神经元分布变化（浅层、中层和深层）

Rbp4-Cre神经元自发活动增强表现为两个阶段（E14.5、E18.5）

Rbp4-Cre神经元在胚胎发育的两个活跃阶段都表现出活跃的传导

Rbp4-Cre神经元在E14.5已存在功能性突触

l Rbp4-Cre神经元在E14.5时已形成活跃回路

选择性地干扰Rbp4-Cre神经元中的ASD相关基因，会破坏胚胎发育过程中的神经元分布和电路组织活动

首先，为了方便大家更清晰的明了文章结构及所用实验方法，理解作者的思路，小优博士对文章做了相关整理并制作了流程图（如下），供大家参考：

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结果具体介绍

01Rbp4-Cre神经元具属于L5-PN

（Rbp4-Cre KL100工具小鼠可标记第5层PNs，其胚胎期PNs，简称为Rbp4-Cre 神经元）

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首先通过single-cell sequencing技术对Rbp4-Cre细胞进行检测，发现该细胞位于新皮层的第五层，属于锥体神经元A。特别，从E13.5开始，Rbp4-Cre神经元表达Bcl11b (Citip2)，其在成人皮层中的表达仅限于L5-PN B。使用越来越多的基因来区分不同成人皮质层的基因表达，发现Rbp4-Cre神经元的基因的表达仍然与L5-PNs的基因表达最相关C。经数据分析，Rbp4-Cre神经元分为三种类型NP, IT, PT D，且与成年L5-PN类型接近E。因此，通过对应关系将每个集群命名为胚胎-NP、胚胎-IT和胚胎-PT。三种Rbp4-Cre神经元类型在每个胚胎日表现出不同的相对比例F。

02Rbp4-Cre神经元的分布变化（浅层、中层和深层）

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鉴于Rbp4-Cre神经元的细胞类型在胚胎发育过程中发生了变化，接下来想知道该神经元的空间组织是否也发生了变化？对于表达GCaMP6s的Rbp4-Cre神经元，每天收集大脑切片从E13.5到E18.5, 并用GFP抗体染色A。Rbp4-Cre神经元分布于发育中的预板的整个深度。E14.5阶段时, Rbp4-Cre神经元已经组织成两个不同的层:皮层表面附近的浅层和皮层板以下的深层。浅层神经元数量随时间的延长而减少，在E17.5之前所有浅层神经元消失B。此外，与深层神经元相比，更大比例的浅层神经元对cleaved Caspase-3(一种凋亡标志物)染色呈阳性，表明浅层神经元的消失主要是发生了凋亡B。为了揭示三种Rbp4-Cre细胞类型是如何分成三层的，我们对每种Rbp4-Cre细胞类型中优先表达的基因进行了原位杂交。发现在E14.5时，浅层和深层主要由胚胎-NP型组成，在E18.5时，中间层和深层均由这三种类型（NP, IT, PT）组成C。

03Rbp4-Cre神经元自发活动增强表现为两个阶段

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接下来研究Rbp4-Cre神经元是否在体内形成活动回路。 对Rbp4-Cre神经元的细胞体C和神经突D进行双光子荧光成像发现，分别在E14.5和E18.5时发生了明显的活动。总之经过一系列研究分析结果：最初，Rbp4-Cre神经元存在于由单一胚胎NP型组成的高度活跃的第一个阶段（中间层和深层），持续到E15.5；从E15.5到E16.5，活动明显下降，与浅层神经元减少和中间层形成一致；到E17.5, Rbp4-Cre神经元切换到一个新的深度（中间层结构），一直持续到出生，第二个阶段（中间层和深层）再次显示出增加的活性，但包含所有三种Rbp4-Cre神经元类型J。

04Rbp4-Cre神经元在胚胎发育的两个活跃阶段都表现出活跃的传导

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为了确定在两个阶段活跃的神经元是否具有活跃的电导，我们对Rbp4-Cre神经元进行了体内双光子靶向膜片钳记录。有趣的是，所有记录的Rbp4-Cre神经元，在E14.5和E18.5处，随着电流阶跃的增加，峰值电压呈非线性增加，显示出有源电导。

05Rbp4-Cre神经元在E14.5已存在突触

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为了确定Rbp4-Cre神经元是否可以与其他Rbp4-Cre神经元形成皮层回路，作者探索了神经元通讯相关基因的表达。发现许多与突触功能和活跃的神经元膜特性相关的基因在所有三种Rbp4-Cre神经元类型中在发育时期E14.5至E18.5表达A。然后探索Rbp4-Cre神经元是否形成突触。对突触前标记Snap25和突触后标记PSD-95进行免疫染色，观察到两种标记物在E14.5和E18.5时均在Rbp4-Cre神经元的神经突上显示B。接下来，我们用电子显微镜(EM)可视化Rbp4-Cre神经元，使用DAB来识别Rbp4-Cre神经元上或外部突触特化的存在。在E14.5和E18.5，我们观察到Rbp4-Cre神经元紧密的连接接触，突触囊泡标记突触前侧，突触后密度标记突触后侧；一些突触有突触前/后Rbp4-Cre神经元；在E14.5，在两侧观察到Rbp4-Cre神经元的突触，即两个Rbp4-Cre神经元之间的循环突触。这表明Rbp4-Cre神经元形成并接受突触接触，并且在E14.5，成对的Rbp4-Cre神经元具有循环突触C-E。

06Rbp4-Cre神经元在E14.5时已形成活跃回路

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为了确定胚胎发育过程中的突触是否具有功能，在Rbp4-Cre神经元成像时应用了谷氨酸能突触传递激动剂A。在E14.5和E18.5中，将AMPA和NMDA的混合物应用于皮质后，所有成像的Rbp4-Cre神经元的钙含量均显著增加B。神经元之间的交流可以导致相关的活动。从E14.5到E18.5，观察到许多Rbp4-Cre神经元对的相关性显著大于随机预期C。此外，Rbp4-Cre神经元在层内和层间延伸轴突和树突D。利用三维声光双光子显微镜，同时记录了两层神经元的情况E，神经元对不仅在同一层内显著相关，而且在不同层之间也显著相关F。

07选择性干扰Rbp4-Cre神经元中ASD相关基因破坏胚胎发育过程中电路组织和活动

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由于神经发育障碍与皮质回路功能障碍相关，作者分析了E14.5和E18.5之间Rbp4-Cre神经元中神经发育疾病相关基因的表达，并将其与成人L5-PNs中的表达进行了比较。许多与精神分裂症和自闭症谱系障碍相关的基因在所有三种类型的Rbp4-Cre神经元中表达A。与两种神经发育疾病相关的基因表达明显高于所有基因的平均表达，与精神分裂症相关的基因表达高出约3倍，与自闭症相关的基因表达高出约4倍B。因此，作者干扰两个已知的自闭症相关基因Chd8和Grin2b，研究它们在Rbp4-Cre神经元中及在胚胎发育期间对这些神经元空间组织的影响。收集E14.5至E18.5的脑切片，观察Rbp4-Cre神经元分布变化。发现在E18.5， 在两种突变体中，Rbp4-Cre神经元分布于新皮层三层（浅/中间/深层），而对照组两层（中间/深层）C-D。另外，在Chd8和Grin2b杂合敲除小鼠中，发现Rbp4-Cre神经元的活性显著增加G。另在突变体中，发现有37.5%无序斑块H。

总之，自闭症相关基因的紊乱不仅对Rbp4-Cre神经元分布产生作用，还干扰了神经元的活性，及影响Rbp4-Cre神经元的组织。

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