蛋白降解靶向嵌合体 （PROteolysis TArgeting Chimeria，PROTAC）可通过泛素-蛋白酶体系统选择性地降解目标蛋白。由于PROTACs可以利用目标蛋白上所有的表面结合位点，无需占据调节蛋白质功能的药物结合位点，因此具有靶向"不可成药“靶点的潜力，相比传统的蛋白抑制剂策略，这一技术极大地拓宽了肿瘤、神经退行性疾病和自身免疫病等疾病的靶点范围。HTRF和AlphaLISA均相检测技术可提供上百种胞内蛋白检测试剂盒，用于高效筛选靶向蛋白降解的PROTAC、分子胶等药物。除此之外，还提供了二元复合物、三元复合物形成的检测方案。本文提供了部分具有代表性的胞内蛋白检测试剂盒及验证的数据。
一、转录因子相关靶点
01信号通路，例：GSPT1靶点
当核糖体被募集到mRNA的5’端时翻译开始。eIF4E结合蛋白（如4EBP1）通过与eIF4E结合阻断翻译。4EBP1过度磷酸化进而影响eIF4E与4EBP1结合活性，从而促进翻译。GSPT1与eRF1相互作用形成翻译终止复合物的一部分迫使蛋白质在终止密码子进入核糖体的A位点时解离。
图1：GSPT1 Signaling Pathway
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02HTRF技术原理
HTRF总GSPT1测定可定量细胞裂解物中GSPT1的表达水平。总GSPT1检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体偶联。两种抗体都对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。在细胞提取物中存在GSPT1的情况下使供体荧光团与受体接近从而产生FRET信号。其强度与样品中存在的蛋白质浓度成正比，提供了一种免洗技术评估蛋白质表达的方法。
图2：HTRF检测Total GSPT1技术原理及流程示意图
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03检测验证
使用分子胶对HAP-1细胞进行总GSPT1检测。三种分子胶CC-885、CC-90009及SJ6986作用HAP-1 WT细胞中GSPT1剂量依赖性降低，而HAP-1 Cereblon KO细胞中GSPT1水平没有显著调节。此外，Α-微管蛋白表达水平保持不变。与文献一致，结果表明，CC-885、CC-90009及SJ6986诱导的GSPT1降解依赖于Cereblon蛋白。
注：1、Cereblon KO细胞即Cereblon knocked-out cell lines。
2、CC-885、CC-90009及SJ6986为已知可降解GSPT1蛋白分子胶。
图3：分子胶对HAP-1细胞进行总GSPT1检测
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使用分子胶对人NSCLC细胞进行HTRF总GSPT1调节NCI-H358。MRT-235分子胶在4小时和24小时后诱导GSPT1蛋白的剂量依赖性降低，DC50分别为153 nM和93 nM。此外，环氧霉素阻止了MRT-2359诱导的GSPT1降解，清楚地表明泛素蛋白酶体系统参与MRT-2359介导的GSPT1降解。
注：DC50是50%的目标蛋白质被降解对应于降解剂的浓度。
图4：分子胶对人NSCLC细胞进行HTRF总GSPT1调节NCI-H358
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HTRF与Western Blot比较。HTRF总GSPT1检测的灵敏度是WB的256倍。
图5：HTRF与Western Blot比较
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| GSPT1 | 64GSPT1TPEG | - |
| IKZF1(IKAROS) | 64IKZF1TPEG | ALSU-TIKARO-A500 |
| IKZF3 (AIOLOS) | 64IKZF3TPEG | ALSU-TAIOL-A500 |
| Full length AR | 64ARFLPEG | - |
| Androgen Receptor-V7 | 64ARV7PEG | - |
| Androgen Receptor | 64ANDRPEG | ALSU-TANDR-A500 |
| Estrogen Receptor-alpha | 64ERAPEG | ALSU-TERA-A500 |
| Progesterone Receptor | 64HPRTPEG | - |
| NRF2 | 64NRF2TPEG | ALSU-TNRF2-A500 |
二、表观相关靶点
在正在研究的抗癌治疗策略中，靶向蛋白质降解有望克服传统小分子的一些局限性。到目前为止，PROTAC分子已被开发用于诱导SMARCA蛋白的选择性降解。然而，SMARCA2和SMARCA4在蛋白质水平上有约75%的同一性，因此化合物可能靶向这两种蛋白。因此，靶向SMARCA2或SMARCA4化合物的选择性研究至关重要。
用两种SMARCA4 PROTAC®降解剂进行细胞处理，SMARCA4蛋白呈现剂量依赖性降低，而ARV-471对照条件下SMARCA4的表达水平以及ATP水平保持稳定。结果表明，PROTAC®诱导了SMARCA2降解。（Farnabay， W. et al. Nat Chem Biol. 2019 和 Xiao， L. et al. Nature 2022）。如下图。
图6：HTRF总SMARCA4检测
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HTRF与Western Blot比较。HTRF总SMARCA4检测的灵敏度是WB的4倍。
图7：HTRF总SMARCA4检测与WB技术比较
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| SMARCA2 | 64SMARC2TPEG | - |
| SMARCA4 | 64SMARC4TPEG | ALSU-TBRG1-A500 |
| CREBBP | 64CREBBPTPEG | ALSU-TCRBP-A500 |
| p300 | 64P300TPEG | ALSU-TP300-A500 |
| HDAC5 | 64HDAC5TPEG | ALSU-THDAC5-A500 |
| BRD2 | 64BRD2TPEG | ALSU-TBRD2-A500 |
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| BRD4 | 64BRD4TPEG | ALSU-TBRD4-A500 |
| BRD7 | 64BRD7TPEG | ALSU-TBRD7-A500 |
| BRD9 | 64BRD9TPEG | ALSU-TBRD9-A500 |
三、蛋白激酶、GTP酶相关靶点
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| 靶点 | HTRF（货号） | AlphaLISA（货号） |
| CDK family | 1/2/4/5161819/12 | 1/2/4/5161819/12 |
| PLK1 | 64ULKPEG | ALSU-TPLK1-A500 |
| ULK1 | 64ULKTPEG | ALSU-TULK1-A500 |
| Wee1 | 64WEE1TPEG | ALSU-TWEE-A500 |
| PINK1 | 64PINKTPEG | ALSU-TPINK-A500 |
| SYK | 64SYKTPEG | ALSU-TSYK-B500 |
| Cyclin E1 | 64CYCE1TPEG | ALSU-TCYCE1-A500 |
| KRAS | - | ALSU-TKRAS-A500 |
| RAS | - | ALSU-TRAS-A500 |
四、内参蛋白相关检测
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| 靶点 | HTRF（货号） | AlphaLISA（货号） |
| GAPDH | 64GAPDHPEG | ALSU-TGAPD-B500 |
| Alpha-Tubulin | 64ATUBPEG | - |
五、细胞活力相关检测
ATP是细胞活力的标志，因为它存在于所有代谢活性的细胞中，因此，ATP的数量与培养中活细胞的数量成正比。如果细胞数量因增殖而增加，那么ATP的数量就会增加；如果细胞数量因细胞死亡而减少，则ATP的数量就会减少。
裂解细胞中释放的ATP在氧气的存在下与荧光素底物、荧光素酶和镁反应产生光，反应原理如下所示。然后使用酶标仪luminescence模块对发射的光进行量化，由此测量的发光信号与样品中ATP的数量成正比。
图8：化学发光法检测ATP原理示意图
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| 名称 | 货号 |
| ATPlite | 6016943 |
| ATPlite 1step（一步法） | 6016736 |
| ATPlite 3D | 6066943 |
| ATPlite 1step 3D（一步法） | 6066736 |
