人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）是一种广泛应用于血管生物学研究中的细胞模型。这些细胞可以从新生儿脐带中的静脉分离获得。相较于成人的静脉或动脉内皮细胞，HUVECs被优选用于实验室研究的主要原因是它们具有干细胞的潜能，理论上可以进行50-60次传代。小优今天要给大家介绍的是HUVEC细胞特性、如何培养。细胞培养的基本内容以及操作原则，大家可以参考《从零开始-细胞培养入门指南》。另外，T细胞和HEK293细胞系的培养攻略大家也可以按需查看《免疫卫士-T细胞培养攻略》《【科研明星细胞】HEK293细胞系培养攻略》。
HUVEC细胞特点
1细胞形态
内皮细胞样，贴壁生长，鹅卵石状外观，具有大的深色细胞核；在增殖期间，细胞小且大小均匀。
HUVEC细胞形态，显微镜(40X)[1]
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2完全培养基
可选择基础培养基+血清的培养体系或者成品完全培养基。
①基础培养基+血清
这种完全培养基一般血清的含量是20%，基础培养基的类型可以是TC199（含有多种维生素、无机盐和微量元素等）、M199（含有独特的成分，包括腺嘌呤、腺苷、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等）或者RPMI-1640（平衡盐溶液BSS+21种氨基酸+11种维生素），关于基础培养基的更详细的内容，感兴趣的老师可以查看《细胞培养常见问题之经典液体培养基篇》。除此之外，也可以再添加相关的细胞营养添加剂或非营养添加剂以补充细胞所需的额外营养或维持细胞培养体系的稳定，必要的时候也可以加入一些抗生素来预防细胞的污染。比如：
ECGF：内皮细胞生长因子，可以显著提高HUVEC细胞周期中的S期细胞数量，促进细胞DNA合成，从而加速细胞的增殖速度；ECGF还能保持HUVEC细胞的正常生理功能，如血管生成能力。
L-glutamine：在细胞培养中，尤其当细胞快速分裂时，L-谷氨酰胺可作为一种辅助能源。
Heparin：肝素可以与某些生长因子结合，增加其稳定性，并促进细胞生长。
HEPES：HEPES对细胞没有营养价值，但是当需要在CO2培养箱外长时间处理细胞培养物时，添加HEPES可提供额外的PH缓冲能力。
Anti-PPLO agent：针对支原体（Mycoplasma）的一种抗菌剂。
Amphotericin: 两性霉素在细胞培养中主要用于防止真菌污染。
更多细胞添加剂的内容，小伙伴们可以查看《细胞“吃得好”，才能长得好》。
HUVEC自配培养基配方[1]
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②成品完全培养基：能够提供一种简便、高效且一致的培养环境，以支持内皮细胞的最佳生长。
| 货号 | 产品名称 | 产品特点 |
| CC-3162 | Endothelial Cell Growth Medium 2 | FBS最终浓度为2%，含有血管内皮生长因子(VEGF)。 |
| abs9873-500mL | 内皮细胞培养基 | 含有必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质。 |
3培养条件
温度：37℃ ；CO2：5%
4传代程序
3-4天传1代，中途2天换液1次，传代比例1:2/1:3
5冻存液配方
含5%（v/v）DMSO完全培养基或商品化冻存液
文章部分相关产品:
原代细胞
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Single Donor, in EGM™CC-2517
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Pooled, in EGM™CC-2519
血清
新西兰胎牛血清SH30406.05
澳大利亚胎牛血清SV30208.02
胎牛血清（优级）abs972-500ml
胎牛血清（标准级）abs974-500ml
基础培养基
M199 with Earle‘s Balanced Salt Solution (EBSS), with L-Glutamine SH30253.01
RPMI 1640 Medium, with 25 mM HEPES, with L-Glutamine SH30809.01
RPMI 1640 培养基，ATCC 改良（含L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠，含HEPES） abs9468-500ml
抗生素
Penicillin-Streptomycin Solution 10,000 Units /mL Penicillin, 10,000 µg/mL Streptomycin in 0.85% NaCl SV30010
青霉素-链霉素溶液（100×，双抗） abs9244-100ml
两性霉素B溶液（10mg/mL）abs9593-10mL
支原体预防/清除
支原体预防剂 abs9376-500uL×4
MycoZap™ Prophylactic (10 x 1 ml) VZA-2031
支原体清除剂 abs9375
MYCOZAP 5 TREATMENT KIT LT07-918
细胞营养/非营养添加剂
L-Glutamine, 200 mM Solution 29.2 mg/mL L-Glutamine in 0.85% NaCl SH30034.01
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) E3010-50mg
Heparin sodium salt abs818914-100mg
HEPES 1M Solution SH30237.01
HEPES abs9424-250g
冻存液
无血清细胞冻存液（科研级） abs9417-100mL
细胞冻存液（含血清） abs9473-100mL
MACS® Cell Storage Solution 130-130-263
HUVEC细胞培养步骤[2]
细胞接种
1.明胶包被：HUVEC细胞需在涂有2μg/cm2重组人纤连蛋白或1%明胶的聚苯乙烯瓶或孔中培养。使用2μg/cm2重组人纤连蛋白或1%明胶包被培养瓶或孔板，置于37℃孵育1h，在加入HUVEC细胞前使用无菌蒸馏水去重组人纤连蛋白或除明胶；
2.以25cm2培养瓶为例，向培养瓶中加入HUVEC细胞悬液（完全培养基中），每两天更换一次细胞培养基，直至细胞达到传代条件。注意：若HUVEC细胞为原代提取或冻存后复苏，可于24h后酌情换液，以去除状态不好的或未贴壁的细胞。
细胞传代
1.HUVEC细胞汇合度达到80%-90%时，可进行传代。使用不含Ca2+和Mg2+的无菌PBS清洗细胞，加入3mL胰酶（0.05%trypsin-0.02% EDTA）于37℃培养箱孵育30-60s，轻柔吹打细胞使其脱落分散；
注意：HUVEC细胞消化时，胰酶浓度不宜过高，一般推荐使用的胰酶浓度是0.05%。另外，该细胞对胰酶消化较为敏感，应避免消化过度。
2.加入10mL完全培养基终止胰酶反应，将细胞悬液收集至15mL离心管中，1000r/min，离心5分钟；
3.弃掉上清，使用完全培养基重悬HUVEC细胞，将细胞调整的合适的密度（2500-5000 cells/cm2）接种到重组人纤连蛋白或明胶包被的细胞培养瓶中。
文章部分相关产品:
明胶或纤连蛋白
Recombinant Human Fibronectin Fragment Protein abs04429-1mg
Fibronectin sc-29011
Fibronectin NBP2-89407MFV610
明胶（A型） abs9135-100g
胰蛋白酶
胰蛋白酶-EDTA消化液（0.05%，含酚红） abs47048304-100mL
胰蛋白酶-EDTA消化液（0.05%，不含酚红）abs47048305-100mL
磷酸盐缓冲液
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X, 0.067M PO4, without Calcium, Magnesium, Phenol Red SH30258.01
PBS缓冲液（1×） abs962-500mL
PBS缓冲液（10×） abs961-500mL
D-PBS缓冲液（1×，无钙镁） abs970-500mL
FAQ
Q1.HUVEC细胞聚团生长怎么办？
A：HUVEC细胞聚团生长可能是由于培养瓶或培养板亲水性差或者血清中的促贴壁因子不足。可采取以下解决办法：①培养瓶或培养板使用前一天使用重组人纤连蛋白或明胶包被；②培养液中添加内皮细胞生长添加剂（如ECGS）③细胞接种时要均匀，并且及时传代。
Q2. 细胞传代后无汇合和/或细胞脱落是什么原因？
①传代时细胞消化过度，导致细胞贴壁性降低；可降低胰酶浓度或缩短消化时间。
②HUVEC细胞本身就是弱贴壁，可以使用重组人纤连蛋白或明胶包被培养瓶或培养板以增加细胞贴壁性。
③细胞传代后密度过低，导致细胞长不起来（无汇合）；细胞传代后合适的接种密度为2500-5000 cells/cm2。
④细胞不幸发生污染，需对应排查细菌、真菌和支原体。
Q3.血清热灭活怎么操作？
A：
①热灭活前须先摇匀解冻后的血清并恢复至室温；
②取部分摇匀血清置于50ml离心管中，并准备同规格对照管一个；
③对照管内加入血清等体积水；
④对照管内插入温度计进行温度预试，当温度达到56℃时将恢复至室温的血清放入水浴锅30min；
⑤灭活过程中需要每隔5min轻轻晃动摇匀，以保证温度均一。
好啦，【血管新生之钥】HUVEC细胞的培养攻略就到这里啦，大家想要了解更多细胞培养的小技巧，可以加入我们的细胞一站式互助Club。
参考文献:
图片
1. Medina-Leyte, D.J., et al., Use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) as a Model to Study Cardiovascular Disease: A Review. Applied Sciences, 2020. 10(3).
2. Marin V, K.G., Grès S, Farnarier C, Bongrand P, Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. J Immunol Methods, 2001 Aug 1. 254: p. 183-90.
