细胞因子是一类具有广泛生物学活性的可溶性信号蛋白。几乎所有的有核细胞，尤其是免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）或白细胞，都会响应特殊刺激（如抗原刺激、紫外线、热休克或其他形式的应激诱导剂）而分泌细胞因子。多数细胞因子由Toll样受体与核因子(NF)KB信号传导途径介导产生与作用，包括IL类、集落刺激因子(CSF)类、干扰素(IFN)类、TNF类、生长因子类、趋化因子类等。
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比如著名的“细胞因子风暴”，细胞因子风暴多种免疫失调疾病，特征是全身症状、全身炎症和多器官功能障碍息息相关，若治疗不及时会导致多器官衰竭。
细胞因子风暴可表现为各种临床和实验室异常。但所有病例均有循环系统内细胞因子水平升高、急性全身炎症症状和继发性器官功能障碍（常为肾、肝或肺功能障碍）。
1、细胞因子风暴判断标准
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2020年，发表在The new england journal o f medicine 杂志上的一篇文章Cytokine Storm（N Engl J Med 2020;383:2255-73.）提出了以下标准来确定细胞因子风暴：
血液循环中细胞因子水平升高；
急性全身性炎症症状以及由于超出对病原体正常反应所能归因的炎症引起的继发性器官功能障碍；
任何细胞因子驱动的器官功能障碍；
细胞因子中和或抗炎药物治疗有效可进一步支持了细胞因子风暴。
2、细胞因子风暴作用机制
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各种诱因导致的免疫细胞过度激活和扩增，活化的T细胞和免疫效应细胞裂解后释放的大量促炎细胞因子和趋化因子(包括IL-1、IL-6、IL-17、IL-12、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ、MCP1等)刺激巨噬细胞、树突状细胞以及内皮细胞的活化。
活化细胞以自分泌或旁分泌等方式又释放出更多的细胞因子，进一步刺激更多的免疫细胞和内皮细胞的活化。
这种级联放大反应通过免疫调控负反馈的缺失和正反馈的不断自我放大而造成免疫网络失衡，最终导致细胞因子风暴的启动，表现出单器官或多器官炎症反应过度，如心血管症状、血液系统症状、肺部症状、急性肾损伤、多器官功能衰竭，乃至危及生命。
3、细胞因子风暴的主要参与者：T细胞
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细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）主要负责对抗病毒感染，CTLs对感染的细胞或肿瘤细胞的颗粒介导的杀伤作用受损是某些形式的细胞因子风暴的关键因素。来自HLH小鼠模型和细胞因子风暴患者的数据表明，CTLs无法有效杀伤导致T细胞持续激活，触发炎症组织损伤的级联反应。
Th1细胞调节巨噬细胞的招募，Th1细胞产生大量的IFN-γ，引起迟发型超敏反应，激活巨噬细胞，这对细胞内病原体的防御至关重要
Th2细胞招募嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞
Th9细胞招募肥大细胞
Th17细胞招募中性粒细胞，Th17细胞在宿主防御中发挥重要作用，尤其是抗真菌保护，异常的Th17细胞功能可能导致自身免疫性
4、血液循环中细胞因子水平是否升高，需要通过对血清、血浆样本检测做判断，那么血清血浆的制备就至关重要
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血清制备步骤
1) 新鲜收集血液样本，室温静置30-45min凝固。
2) 离心（4℃,1000g，10-15min），取上清转移到干净的试管中。
3) 二次离心（4℃,10000g，10min），完全去除血小板及其他沉淀物。
4) 标记样本采集日期、时间、批号、来源等。
5) 若当天检测，4℃储存；若隔天或更久之后检测，-80℃储存，以10-30μl分装储存，避免反复冻融。
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血浆制备步骤
1) 抗凝采血管收集。
2) 离心（4℃,1000g，10-15min），取上清转移到干净的试管中。
3) 二次离心（4℃,10000g，10min），完全去除血小板及其他沉淀物。
4) 标记样本采集日期、时间、批号、来源等。
5) 若当天检测，4℃储存；若隔天或更久之后检测，-80℃、10-30μl分装储存，避免反复冻融。
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5、血清与血浆的区别
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6、获得血浆样本的几种抗凝剂的选择
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不同的抗凝剂对实验结果的影响
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从4名健康志愿者使用不同的血液采集管采血（抗凝剂分别是肝素钠、EDTA和柠檬酸钠），获得血浆样本，采用多重法测定血清+三种血浆样本中的细胞因子表达水平。
大多数细胞因子以低水平或无法检测到的水平存在。只有IL-18可检测到，并且在不同的样品采集管之间没有差异。
柠檬酸盐处理的血浆样本中，IL-6水平更高，而CXCL8在血清中检测的浓度最高。
7、短期保存2-15个小时对实验结果影响
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A图：血清样本，保存时间分别为baseline，2H, 5H, 15H，检测差异差异较大的指标是CXCL5,IL-7, BDNF
B图：血浆样本，保存时间分别为baseline，2H, 5H, 15H，检测差异差异较大的指标是IL18,IFNG,IL12,IL15,IL10,IL27,TGFB,IFNA,LIF,NGF。
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血清和血浆细胞因子受到温度和处理延迟的不同影响。
热图显示62种细胞因子在血清(A)和血浆(B)相对于baseline的%变化。
红线箭头代表上升；蓝色箭头代表下降。
8、短期保存7天对实验结果影响
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样本：144名健康人serum血清样本（分别为Day 0&Day 7天）
检测方法：Luminex-100 instrument (Luminex, Bio-Rad), + 27-plex kit+Bio-Plex Manager software version 6.2 (Bio-Rad).
IL-2、IL-15和GM-CSF的中位浓度在任何一个时间点均未检测到。
PDGF-BB和RANTES的中位浓度最高。
27种细胞因子中只有5种在第0天和第7天之间的浓度上有显著差异： RANTES（p=0.0009）、MCP-1（p=0.014）、VEGF（p=0.02）、MIP-1β（p=0.02）和PDGF-bb（p=0.03）。其余19种分析物在第0天和第7天之间的浓度没有显著差异。
9、长时间（1-4年）保存对实验结果影响
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诱导细胞因子谱的长时间稳定性。
用LPS和PHA联合刺激3个个体的肝素钠全血，诱导细胞因子谱。
在基线(BL)和不同时间点测量样本。
10、反复冻存对实验结果影响
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多次冻融循环后细胞因子的恢复。
相同LPS/PHA刺激样品的等量新鲜解冻或进行多次冻融循环，同时测量细胞因子。
推荐阅读
Reference:
1．Baseline Levels and Temporal Stability of 27 Multiplexed Serum Cytokine Concentrations in Healthy Subjects.
2．Cross-platform Comparison of Highly Sensitive Immunoassay Technologies for Cytokine Markers: Platform Performance in Post-traumatic Stress Disorder and Parkinson’s Disease.
3．Cytokine Storm.
4．Cytokine Storm—Definition, Causes, and Implications.
5．Efects of processing conditions on stability of immune analytes in human blood.
6．Prerequisites for cytokine measurements in clinical trials with multiplex immunoassays.
7．Serum cytokine profles in healthy nonhuman primates are blunted by sedation and demonstrate
8．sexual dimorphism as detected by a validated multiplex immunoassay.
