白 罗工，罗工，上次提供数据分析前的预处理我都做过了，接下来是不是就可以进行常规的圈门分析？
罗 是的，接下来就可以进行圈门，但是在设门的时候，有一些必要的流程还是不可或缺的。
白 是什么，快说说，我已经迫不及待要学习了
罗 手动设门：去黏连细胞、死活细胞、目的细胞总指标
1、去黏连细胞
从流式细胞术基础原理可知FSC、SSC可以判断细胞的相对大小，那FSC、SSC都小的位置为碎片，一般呈现在左下角。
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当细胞通过检测激光器时，是有细胞进入到流出的过程的，在光信号拟合成电信号，再转变成数字信号时，体现在各个光参数的W(细胞流入到流出的时间)，H（细胞和激光器正交时最大的光信号值），A（W和A的积分值），所以单个细胞和黏连细胞可以通过同个光参数的A-H、A-W、H-W组合的散点图展示出区别，比方FSC-A和FSC-H组一张图，排除掉当FSC-H值相等时FSC-A值变大的细胞群。
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2、死活细胞
死细胞有自发荧光，且更容易粘附荧光染料，可以通过死细胞染料将死细胞剔除，避免后续死细胞的非特异信号干扰样本的生物学功能结果。
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3、目的细胞总指标
单细胞悬液成分复杂，在具体研究中一般都会加入目的细胞普遍表达的生物学标志物，作为分析对象的总指标（或说是求下游亚群细胞的占比的分母），比如免疫相关研究中常用CD45。
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样本数量比较多的话，还可以使用ElastiGate（AI矫正圈门）完成
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白 I got it，但是我这设门后，每个样本数据都不一样多了，咋办？
罗 不必担心，DownSample这个插件可以帮助我们，将每个样本导入分析前，目的细胞随机减少到相同数量，因为是随机均匀的减少的，所以样本里的各个群体的细胞占比不会发生变化。
标准化：DownSample
白 降维聚类分析每组要选择多少个样本进入分析呀？
罗 其实有条件的话可以都放入，就像单细胞测序一样，样本越丰富越异质。但我们的电脑往往带不动那么大的数据量的，做高阶分析的目的也是在用更小的篇幅，更直观展示结果，所以可以每组选择代表的样本，或者都DownSample到比较小的数量级再合并分析。
白 DownSample到比较小的数量级会不会丢失占比很低的细胞群？
罗 会的，占比很低的亚群的差异要展示的话，最好要排除占比最高的群体后，也就是目的细胞，这样分析选择范围缩小一些。
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整合：Concatenate (加Keywords)
白 罗工我还有个疑问，Concatenate时的样本顺序可以调整吗？
罗 这里可以加入Keywords，帮助对样本进行排序。
白 经过这么一系列的优化，我可以进入降维聚类了吗？
罗 还不可以。
罗 我们都知道个体都有差异，那么不同样本的细胞上的蛋白也是有差异的，它们可能都是T细胞，但来自A样本的一个细胞CD3的表达量和来自B样本的一个细胞的CD3的表达量就不同，如果我们直接降维聚类分析，就会被降维聚类在不同的位置上，A、B样本相互独立，我们就没办法分析样本之间的真正的差异。所以在降维聚类前，我们需要做归一化，把A样本和B样本的相同参数的平均值拉成一致，看离散出来的细胞的差异。
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归一化：CytoNorm、MNN、cyCombine
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白 罗工，聚类之后不分群怎么处理呀？
罗 需要先优化好每个参数的T值，让细胞阴阳群分布得当，降维聚类才正确也更好看哦。
罗 导入整合数据后需要矫正每个参数的T，下图可以看出调节T值，分群更清晰。
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白 学到了，罗工我还有个问题，Flowjo的插件那么多，要如何选择才会更合适？
罗 这个问题下次给你讲解吧，掌握好今天所学才是硬道理！
