如何发现并修正荧光补偿调整过度？
很多流式小伙伴一聊到流式细胞术的补偿调节，就会头皮一麻。
确实流式细胞术的补偿调节是非常影响实验结果的一个环节。虽然说现在流式细胞术本身支持很多种调补偿的方式，比如我们在上机的时候可以使用补偿微球来调整补偿，或者我们可以制作标准样本来调节它的荧光补偿，但不论哪种方式，相信大家有过实际作战经验的都会发现在实际调节之后多多少少这个补偿调节还是存在一定的出入的。为什么流式细胞术的补偿调节不一定准？
罗工有话说
在我看来，流式细胞数补偿调节不准主要有以下一些原因：
一、样本本身可能比较复杂，流式样本的细胞类型比较多样，我们检测的样本在不同的干预情况下，它也会导致细胞的形态结构出现差异，这些都是有可能会影响到我们的补偿值的。
所以即便是同一次上机的两个样本，他们本身之间也会存在着微小的差距。
二、像我们的流式细胞仪本身，它的光学系统也会存在一定的畸变，如果我们在两次上机之间没有做相应的对照质控的话，检测的灵敏度和差异性也会比较大。
最后，我们自己的人为操作有时候也会引起我们的补偿结果出现比较大的差异。
所以在实际的荧光补偿调节过程中，经常会碰到老师问到如下的一种问题，就是为什么我有的样本实验结果还行，但是有的样本我的阴性细胞群后面为什么还有一些细胞？其实这就是因为荧光补偿调节不准，导致荧光补偿调节过度产生的一种现象。
例如：
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上面这张图中，绝大多数的阴性细胞群都位于0左右，但是在0的左边却存在了一群散在的细胞群，这样就让很多老师误解，那么以0的这一群到底是阴性还是阳性？还是说左边这一群散在的细胞群才是真正的阴性细胞群？
今天，我就来教大家一种简单的办法，快速判断你的当前通道的阴性细胞群是否是补偿过度造成的。以刚刚这张图为案例，我们Ly-6G-fitc通道存在这种阴性后还有阴性的现象，此时我们可以采用如下步骤：
1.把数据分析图的横轴标定为Ly-6G，并且通过自定义参数轴将尽快能多的负轴显示出来：
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通过Transforms的调节，让阴性细胞全部显露出来。
2.切换纵轴，分别观察每一个纵轴下和横轴ly-6g形成的图像：
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3.观察所有的图像中纵轴的阳性细胞群形态，尤其是ly-6G阴性群左边的这群细胞的形态；
如果形态是类圆形，则不存在荧光补偿过度的问题，如下：
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如果形态在被观察坐标轴是阴性位置，则也不存在荧光补偿过度的问题，如下：
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当发现纵轴的阳性细胞群是呈现连续性整体反曲到阴性细胞群时，恭喜你发现了问题所在，此时正说明该通道的荧光补偿被我们调节过度了：
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接下来要做的事情就是修正我们的补偿过度的现象，我们打开flowjo的补偿矩阵，将对应的补偿过度的通道值进行减少：
调整前：
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调整后：
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此时我们发现大部分负轴群已经被修正了，但是仍然存在一小部分负轴群提示我们还存在其他通道的补偿过度情况。
这就是值得我们注意的地方了，有时候可能不是只有一个通道存在调节过度的现象，即便我们发现了一个调节过度的通道，我们仍然要把其他未check的通道check一遍。再次check后，我们发现V450也存在了一定的补偿过度情况：
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当V450也被修正后我们回到最初的Ly-6G/SSC，发现阴性后的阴性细胞群彻底消失了：
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其实，当我们发现很多细胞群存在异常的时候，往往不是因为我们的这个结果真的存在这样的一群细胞群，而是因为我们的荧光补偿的调节出现了变动，导致出现了这样的一群异常的细胞群，我们所需要做的就是认真的去考虑、排查，找出这些变动，并且去修正它，这样我们的流式结果就可以重新变得美丽了。
怎么样，今天这个小妙招你学会了吗？
