Reference:A 30-color panel for analysis of check-point inhibitory networks in the bone marrow of acute myeloid leukemia patients
OMIP是国际流式学会旗下Cytometry PART A杂志中的专栏，全称为：Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels。目的是为多色方案的科研人员提供素材，减少其方案的开发时间，提高实验效率。
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急性髓系白血病(AML)是成人最常见的急性白血病。
目前，各种免疫治疗方法，即CAR-T细胞、BiTEs和免疫检查点抑制剂，正在临床试验中进行测试，以延长并提高AML患者的总生存期。
然而，早期的报告显示这些干预措施的益处有限，只对一小部分患者有效，这表明需要基于免疫标记物对患者进行更好的分层。
因此，本文开发并优化了一个30色面板，用于评估效应免疫细胞(NK细胞，γδ T细胞，nkt样T细胞和经典T细胞)浸润骨髓，并分析其分化，表达抑制(PD-1, TIGIT, Tim3, NKG2A)和激活受体(DNAM-1, NKG2D)的表型。
并通过分析PD-L1、CD112、CD155和CD200等抑制配体的表达来评估CD33+骨髓细胞、CD34+CD38-和CD34+CD38+造血干细胞和祖细胞的免疫表型。
基础信息
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流式方案
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流式结果
急性髓系白血病（AML）骨髓样本（BM 1）的门控分析。在手动门控之前，使用FlowAI算法进行质控。
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（A）首先，进行清除门控，清除碎片、粘连体、死亡细胞和CD45阴性细胞。
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（B）在CD45+细胞中圈出T细胞。CD3+细胞被分离为γδTCR+ T细胞和γδTCR- T细胞，并进一步形成亚型。γδTCR- T细胞根据CD56的表达分为CD56+CD3+ NKT-like细胞，代表iNKT细胞和高度激活的T细胞，以及CD3+CD56-经典T细胞。在所有已鉴定的亚型中，我们进一步鉴定了CD4和CD8的表达。在经典的γδTCRCD56-CD3+CD4+ T细胞中，我们鉴定了CD25+FoxP3+Treg和CD4+CD25+/-FoxP3-效应T细胞（非treg）。treg被进一步分型为CD39-treg和高度抑制激活的CD39+treg。在所有亚群中，确定了基于CD45RO和CD62L的分化图谱，以识别TCM、TEM、TEFF和由幼稚干细胞和记忆干细胞组成的异质群体TN_TSCM。
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（C）绘制CD33/CD56图谱并选择CD56+CD33-细胞，NK细胞在CD3-亚群中进行门控。随后，使用清除CD45hi门去除污染的髓系细胞，包括SSC增加的活化NK细胞。最后，鉴定出CD56hi和CD56lo NK细胞。
（D）为了鉴定成髓细胞和HSPCs，使用放置在CD45lo细胞上的门，排除了CD33 vs CD45图上剩余的成熟CD45hi白细胞。后通过门控CD33和CD34，鉴定了CD45loCD33+成髓细胞和CD34+HSPCs。CD34+HSPCs根据CD38的表达情况分为两个亚群。由于患者样本中CD38的表达高度可变，因此使用FMO对照来设置CD38+和CD38-细胞的门。
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（E）在患者样本中，TIGIT和Tim3的含量较低；因此，使用抗cd3抗体刺激3天，分析TIGIT和Tim3的表达。门是基于FMO设置的。
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（F）直方图显示不同T细胞和NK细胞不同亚群中抑制和激活分子的表达。
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（G）由于成髓细胞和AML（BM1-4）中标记物的表达高度可变性，单个共抑制配体和共刺激配体在HSPCs上的表达描绘了不同的患者样本。门是基于FMO设置的。
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（H）以直方图显示在患者BM1的成髓细胞和HSPCs亚群上表达的免疫调节分子。由于AML中共抑制性受体和抑制性配体的表达是高度可变的，无法识别出所有标记物都呈阳性的患者。必须对一些患者进行筛查以观察阳性表达。
如前所述，抗白血病反应的结果不仅取决于免疫效应物的特性，还取决于白血病细胞在免疫过程中形成的防御机制。包括了免疫抑制受体、共刺激受体和外酶CD39的配体来形成这些特性。
在抑制性受体配体中，PD-L1是研究最多的，其他抑制配体是CD112 (PVRL2)和CD155 (PVR)。这些配体在AML母细胞上广泛表达，并已被证明通过与TIGIT的相互作用来抑制NK细胞的细胞毒性。此外，单独抑制TIGIT信号通路或联合抑制核苷三磷酸二磷酸水解酶（NTPDase）CD39可以促进NK细胞介导的对AML细胞的细胞毒性。
CD200是AML细胞表达的另一个重要的抑制性配体。CD200被认为是LSC的标志物，在抑制NK细胞和T细胞中起重要作用。
CD200也被证明是一种与核心结合因子AML中较低的总生存率相关的阴性预后标志物。另一种由AML细胞表达的抑制性配体是CD276（B3-H7）。CD276在AML中的作用仍在研究中。最近的报告表明，因为免疫逃避的作用，CD276（B3-H7）高表达与不良结果相关。此外，使用阻断单克隆抗体的实验改善了NK细胞介导的AML细胞裂解。
AML细胞也表达共刺激分子。其中，CD275（ICOS-L）已被认为是一种促进Treg分化和扩张的免疫逃逸分子。CD86是一种共刺激分子，对免疫反应很重要。然而CD86也可以通过CTLA-4传递信号，抑制t细胞反应。在AML中，已观察到CD86表达与免疫浸润之间的关联。
综上所述，本panel适用于评价AML母细胞的免疫逃逸机制和对效应免疫细胞的抑制。它是用骨髓样本设计的，但同样也适用于外周血。
