蛋白质磷酸化是最常见和最重要的翻译后修饰（PTMs）之一。磷酸化调控机制由激酶、磷酸酶及其底物磷酸结合蛋白组成，蛋白质通过三磷酸腺苷（ATP）水解和激酶的酶活性获得磷酸基团。自1992年E.H.Fischer和E.G.Krebs两位科学家因发现可逆性蛋白质磷酸化而获得诺贝尔奖以来，磷酸化在所有生命过程中的重要作用一直是研究热门。
当我们采用实验动物组织作为样本来研究磷酸化蛋白，时常会遇到这样的问题：动物相同，但是不同批次的实验却会有令人费解的不同结果。这是什么原因呢，今天小优细节君带大家来一探究竟。
图1 磷酸化机制
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这里介绍一篇宝藏文章，作者做了大量WB实验，还有多项对照，证明了死后间隔时间PMI（Post-mortem Interval）对磷酸化蛋白的影响。研究指出，小鼠被处死后，组织中磷酸化蛋白质迅速发生改变。心脏、肝脏、肾脏这几种组织中的大部分磷酸化蛋白在死后20s到10min的时间内迅速去磷酸化。例如Tau在Thr212的磷酸化以及GSK-3β在Ser9的磷酸化在死后40秒就减少了50%，请注意，这是正常的提取组织操作时间，不是长期放置。
图2 PMI对不同蛋白磷酸化的影响
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作者还发现不同的组织处理方法对于磷酸化蛋白表达也是有影响的。图3中control是未灌注的，直接放-80度保存的结果，RT/Cold PBS是分别用常温/预冷PBS进行灌注之后的结果。对比发现，未灌注组的蛋白表达最高，如果一定要进行灌注，使用预冷PBS灌注可以有效减少磷酸化改变。
图3 灌注/不灌注样本检测到的磷酸化蛋白
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结合文章和我们的经验，总结几点减少组织中蛋白质磷酸化改变的方法：
01 预冷PBS短暂保存
以Tau蛋白为例，不同位点的磷酸化蛋白基本都是随PMI时间增加而表达减少， T212位点的磷酸化在2min后已经检测不到了。但是我们在实际取样过程中，尤其是大批量动物实验中，无法立即将组织放入-80度冰箱，这时我们可以将组织放入预冷的PBS中进行短暂保存。对比图4和图5可以发现，在预冷PBS中保存的组织，磷酸化蛋白可以更加稳定，T212在10min仍可检测到明显的条带。当然，时间不能太久，建议10min内要转移到-80度冰箱。
图4 多种p-Tau蛋白受到PMI影响
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图5 冰冷PBS短暂保存后检测p-Tau
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02 麻醉/灌注处理
图3的结果显示未灌注组的蛋白表达最高，所以我们在实验中尽量避免灌注处理，如果一定要灌注，务必使用预冷的PBS进行灌注，灌注时间也要缩短。
在某些动物实验中，我们可能还会用到麻醉处理，麻醉其实也会影响蛋白的磷酸化水平。有研究报道，麻醉处理增加了GSK3的丝氨酸磷酸化，这意味着检测到的不是动物死亡前的真实磷酸化水平。所以，我们应尽可能避免麻醉处理，如果必须要，那就做好对照，并且保持批次间操作一致。
图6 麻醉处理对磷酸化蛋白影响
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03 添加磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂
在做磷酸化蛋白时，磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂需要同时加入。有很多小伙伴问过这个问题，是不是只加磷酸酶抑制剂就行了。磷酸酶抑制剂是无法有效抑制蛋白酶的，如果总蛋白都降解了，如何去检测磷酸化呢？所以如果只加了其中一种抑制剂，很容易检测不出。如果觉得麻烦，最好是买抑制剂cocktail，效果如下：
图7 蛋白酶/磷酸酶抑制剂作用效果
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04 总蛋白对照
随着PMI时间增加，不仅磷酸化蛋白表达减少，总蛋白也在减少。如果只有磷酸化蛋白的结果，是无法说明问题的。一定要用总蛋白归一化才能准确地反映磷酸化水平变化。
现在很多期刊都已经在投稿要求明确了总蛋白的标准。点此查看更多。
图8 总蛋白和磷酸化蛋白都会随PMI时间改变
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参考文献：
1. Yifan Wang, Yanchong Zhang, Wen Hu et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Sci Rep.（2015）5：15709.
2. Ardito F, Giuliani M, Perrone D et al. The crucial role of protein phosphorylation in cell signaling and its use as targeted therapy. Int J Mol Med（2017）40(2):271-280.
3. Li, X., Friedman, A. B. et al. Anesthesia and post-mortem interval profoundly influence the regulatory serine phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 in mouse brain. J Neurochem 92, 701–704 (2005).
4. Li, J., Gould, T. D., Yuan, P. et al. Post-mortem interval effects on the phosphorylation of signaling proteins. Neuropsychopharmacol 28, 1017–1025 (2003).