每天跑10块WB胶，拍10块Elisa板子，再加上30张IHC切片染色，你还在这样做实验吗？不仅眼花脑胀手抽筋，而且一不留神可能就加错了样品
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生物系统是一个极为复杂的系统，单一指标往往无法全面反映系统的状态。通过检测多个指标，研究人员可以更好的揭示细胞成分、细胞功能和细胞间相互作用和信号通路间的复杂网络，对于更深入地理解肿瘤的复杂病理过程和免疫反应机制具有重要的意义。
多个指标的检测就一定会增加成倍的工作量嘛？非也。使用正确的多指标检测技术往往能实现事半功倍的效果。由于一次实验可以检测多个指标，平均下来一个指标也只要几十-几百元，真是省时省钱又省力！
本文会为大家介绍以下多指标检测技术：
分子多指标检测：PCR array，多重荧光PCR
蛋白多指标检测：Luminex，CBA，MSD，抗体芯片
组织多指标检测：mIHC（TSA、SignalStar™）
分子多指标检测
01 PCR array
PCR Array，也被称为功能分类芯片或者PCR列阵，是一种灵敏度极高，且及其可靠的基因表达谱分析技术。它结合了实时定量PCR的高灵敏度与微列阵技术的同时检测多种基因表达量的优势，来聚焦分析一个孔板中84个用于信号传导、生物过程或疾病研究通路中的重要基因表达量的变化，发掘标志性基因。
如何实现多指标检测？
PCR array将客户想要研究的信号通路或者疾病中的重要基因的引物预先包埋在PCR 96孔板中，通过在每个孔中加入样品，即可快速检测样品中多个基因的表达。
PCR array每个孔中预先包被有不同基因的引物
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操作是否复杂？
PCR array的孔板中已预先包埋好引物，因此只需将提取的RNA逆转录成cDNA，将cDNA和SYBR mix混匀后加入到PCR array板中，然后使用荧光定量PCR仪进行检测并进行数据分析即可。
PCR array实验流程
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可以检测多少种指标？
一块PCR array的96孔板可以检测某信号通路或生物学功能相关的84个特异性基因和5个管家基因。
技术优势？
PCR Array是分析信号通路或者生物学功能相关基因表达状态的首选工具。PCR array每个孔板包含有信号通路或者生物过程相关的多个重要基因，这些基因是专业的科学家团队通过阅读已发表文献和多个数据库的信息筛选出的关键基因，无需再检索文献或者前期实验验证，免去复杂的引物设计和实验条件的摸索过程，实验所得到的数据分析图可以直接用于文章发表。
此外，PCR Array还有以下优点：
1、重复性高：经过反复验证，PCR Array具有非常好的技术重复性。
2、兼容性好：PCR Array涵盖人、小鼠、大鼠、狗、恒河猴、猪、牛、鸡、马、兔、CHO细胞、果蝇、斑马鱼等不同物种的200多条信号通路中几乎任何基因的表达，满足各种科研要求。
3、引物准确性高：引物经过实验室设计和验证，可确保每个PCR反应都产生单一产物条带，无引物二聚体或非特异扩增。
4、不需要特殊仪器：可在任何一款常见的荧光定量PCR仪上使用。
5、免费数据分析：可使用Qiagen免费的数据分析软件进行高质量分析。
02 多重荧光定量PCR
多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction，MPCR) 是指通过一次 PCR 反应同时对多个靶标进行扩增，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。
如何实现多指标检测？
TaqMan水解探针 (Hydrolysisprobes) 是多重荧光 PCR 体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的 TaqMan 水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。
Taqman探针示意图
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操作是否复杂？
多重荧光PCR需要设计多对引物和多条不同荧光信号的探针，把引物和探针都加入到同一个cDNA样品中然后进行正常qPCR扩增和检测即可。
可以检测多少种指标？
一般来说一个反应体系中最多可以进行4个指标的检测。
技术优势？
多重荧光PCR可以支持在一个反应体系中同时检测多个靶标，节省样本量和成本，同时提高实验效率，帮助研究者快速、准确地了解特定生物学过程或疾病状态下的多个基因表达的变化。
蛋白多指标检测
01 Luminex
液态流式(Luminex)又称流式荧光、悬浮阵列、液相芯片等，是近20多年逐渐发展起来的多指标联合诊断技术。该技术以荧光编码微球为核心，集流式原理、激光分析、高速数字信号处理等多种技术于一体，多指标并行分析，可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等多方面、多领域的研究。
如何实现多指标检测？
Luminex技术使用不同配比的两种红色荧光染料将聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，获得多个荧光编码的微球。进而将针对不同待测分析物的捕获抗体共价偶联到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测物。将偶联有不同捕获抗体的荧光编码微球混合，加入待测样本及生物素标记的检测抗体，所形成的夹心抗体对复合物再与标记荧光素PE发生反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，通过激发后的信号强度进行最后的样本定量。
每种染料都有10个浓度梯度，因此通过混合不同比例的两种染料就能拥有100种颜色的组合阵列，使用其中一个颜色的微球来作为某一蛋白靶标对应抗体的专属载体。
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每个孔可以放置多个标记有不同捕获抗体的微球，从而在单孔中实现单个样品多指标同时检测。
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操作是否复杂？
在孔板中先加入样品和多个磁性微球共同孵育，然后加入检测抗体使用Luminex仪器进行检测，只需4个小时可同时检测多达100种生物靶标，比做Elisa轻松几十倍！
Luminex实验步骤
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可以检测多少种指标？
25-50ul样品可以实现最多单孔100种指标同时检测。
技术优势？
多指标同时检测可以大大减少生物样品的消耗量，节省成本和测定时间，并且使多种目标分子之间相关性的分析更加准确。
1、多重检测：可最多同时检测100种生物靶标；
2、节约样本：只需低至25ul的样品体积；
3、节省时间：多因子检测实验过程只需4小时；
4、高灵敏度：精确定量下限低至0.1pg/mL
02 CBA
CBA是一种结合流式细胞仪荧光检测和微球免疫分析的应用技术，通过使用多个带有特定荧光强度的微球，能够检测单个样品中的多个指标。
如何实现多指标检测？
利用荧光强度不同的微球，上面带有可以辨认特定蛋白的抗体(capture antibody),与样本及PE检测抗体（detection antibody）作用后，使用流式细胞仪进行分析，根据PE荧光强度的不同用进行分析和标准品做比对后，可进行样本内目标蛋白的定性或定量。
每个微球带有不同的荧光强度，每个孔可以放置多个标记有不同捕获抗体的微球，从而在单孔中实现单个样品多指标同时检测。
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操作是否复杂？
CBA的实验操作也并不复杂，先把样本和不同荧光强度的微球和PE标记抗体共同孵育，然后使用流式细胞仪进行操作和数据分析即可。
CBA实验流程
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可以检测多少种指标？
25-50ul样品单孔可最多同时检测30种指标。
技术优势？
流式CBA技术可以实现对稀有样本、少量样本的细胞因子、抗体、抗原等多个指标的检测。CBA技术以其检测速度快、检测手段灵活、多指标、多参数、灵敏度高等特点已经成为基础科研、临床检测等必不可少的技术手段。
1、多重检测：可最多同时检测30种生物靶标，实验重复性高；
2、样品量少：每次检测仅需25-50ul的样品体积；
3、实验步骤简便：仅需3-4小时，快速上样；
4、高灵敏度：灵敏度可达0.274pg/mL
5、结果分析容易：利用配套的FCAP Array软件，多样本也可快速完成分析。
03 MSD
超敏多因子电化学发光技术（MSD）是一种超高灵敏度和宽线性范围的多指标免疫分析技术，它结合了电化学和化学发光两个过程，用于定量检测蛋白质、细胞因子、抗体等生物分子。
如何实现多指标检测？
MSD通过双抗体夹心法来定量检测目标蛋白。MSD采用了石墨烯材质的电极板作为反应容器，同时利用SULFO-TAG（三联吡啶钌）替代传统的酶或荧光染料标记在检测抗体上，当电极板通电时，SULFO-TAG发生一系列氧化还原反应，产生光信号，随后被仪器内的CCD相机捕获。
MSD 96孔板中每个小孔内又有10个小孔，每个小孔偶联不同的捕获抗体，从而在单孔中实现单个样品多指标同时检测。
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操作是否复杂？
MSD和ELisa操作步骤类似，加样品之后需要洗涤然后加检测抗体，最后再使用MSD仪器进行分析和检测。由于MSD每孔可以检测10个不同指标，因此检测10个指标只需要操作一块96孔板即可（Elisa需要操作10块板！），极大的节省了人力，样本和时间！
可以检测多少种指标？
10-25ul样品单孔可最多同时检测10种指标。
技术优势？
MSD的一大特点是超高的灵敏度及更宽的线性范围，它的灵敏度可达到fg级别，并且具有很好的批间稳定性。MSD技术在免疫学、疾病研究和药物开发等多个领域均得到了广泛应用。特别是在神经退行性疾病的研究中，MSD已成为aβ38、40、42等蛋白检测的金标准，仅需10微升的样本量即可定量检测这些分析物。
1、高灵敏度、宽线性范围：线性范围可达 6log ，灵敏度 <0.05~1pg/mL，信号稳定且不受显色顺序影响；
2、节省样本，可实现多重检测：节省样本用量，上样量只需≤25ul，为珍稀样本的研究提供了更多的数据。
3、均一性、重复性高：板内CV<6-8%,板间<10%,批间<15%。同时MSD试剂盒有效期长达30个月，为长时间研究项目，提供了使用同一批号试剂的可能性。
4、样本兼容度高，基质效应小：适用于各类生物学样本，包括但不限于：血清，血浆，培养上清，细胞/组织裂解液，脑脊液，尿液，眼睛房水，灌洗液等生物学样本。
04 抗体芯片
抗体芯片技术是一种具有微型化、集成化、高通量化特点的蛋白芯片技术，主要用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达丰度。
如何实现多指标检测？
每张抗体芯片上都预先高密度地固定有和不同抗原特异性结合的多种抗体，使待测样品通过芯片表面，经过洗脱把非特异性结合的蛋白洗掉，从而对特异性结合在上面的抗原进行检测。
每张芯片上高密度的固定有不同检测指标的抗体
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操作是否复杂？
抗体芯片也是采用了双抗夹心法进行检测，主要步骤包括先加样品，再加检测抗体，然后使用化学发光仪进行检测。只需加一次样品，就可以同时检测超过1200个指标。极大的节约了样品和时间。
抗体芯片操作流程
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可以检测多少种指标？
单张芯片可定量检测指标数：人类蛋白≤1200，小鼠蛋白≤640，大鼠蛋白≤67。
技术优势？
芯片上的抗体都是经过科学家团队通过文献或者数据库筛选后的信号通路或者生物学过程中的重要指标，包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，跨度大、适用范围广。非常适合于做蛋白激酶信号通路，磷酸化受体，细胞因子，趋化因子和肿瘤生物标志物等筛选。
1、多指标检测：仅需50-100ul样品就可以快速实现多达1200种指标检测，整个分析过程可以在一天内完成；
2、高灵敏度：芯片上的抗体分别经过特异性抗原、细胞系和组织的检测，灵敏度高达pg/ml；
组织多指标检测
01 TSA mIHC
TSA mIHC，又被称为多重荧光免疫组化TSA技术，是指基于酪胺信号放大（TSA）技术，利用抗原抗体反应对样本中多种蛋白标志物进行染色标记，实现在同一组织切片上多个靶标蛋白共同染色（最多可实现九种蛋白的共染色），从而通过荧光图像分析挖掘组织微环境中的复杂信息，如定量分析、共表达确定细胞分型、空间关系分析等等。
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如何实现多指标检测？
TSA和普通IHC的主要区别是，TSA引入了酪胺荧光素，非活化的酪胺荧光素在HRP催化下形成共价键结合位点能与组织抗原中的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)直接结合，从而避开了对一抗和二抗的持续依赖。TSA通过多轮抗体孵育和洗脱，从而实现对多指标的检测。
酪胺荧光素直接和抗原结合
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不同波长的酪胺荧光素和多个抗原结合
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操作是否复杂？
TSA前期的操作步骤和传统的IHC类似，只不过在使用血清封闭之后进行多轮抗体孵育和洗脱，最后再使用荧光显微镜进行成像分析。TSA可以实现在一张切片上最多10色的染色，如果做传统的IHC实验需要做10张连续切片，TSA一张切片就可以实现。
可以检测多少种指标？
在一张切片上最多实现九标十色（即九个待测指标+DAPI）
技术优势？
相比于传统的免疫组化，mIHC在复杂的肿瘤微环境中蛋白表达和相互作用或其他生理过程中有较高应用价值，尤其是在样本量稀少的情况下，可以做到一张切片同时检测多达9种指标。mIHC可以提供更多的空间信息，帮助研究者更好的理解肿瘤免疫微环境中不同类型细胞间的空间关系，从而为免疫治疗提供重要的生物标志物。
还有其他的一些优势，包括：
1、信号放大：TSA技术能够显著增强荧光信号，提高检测灵敏度，使得低丰度靶标也能被有效检测。
2、多重染色： 能够在一张切片上实现多达6-8种靶标的共染色，提供更多生物信息。
3、种属不限： 由于每次染色循环后可以通过热修复去除上一循环的抗体，因此不受一抗种属的限制。
4、节约样本：使用样本稀有情况下的多指标检测。
5、荧光稳定性： 染色后的组织切片可以长期保存，荧光信号不易淬灭。
02 SignalStar™mIHC技术
SignalStar™ mIHC技术，又被称为多重荧光免疫组化SignalStar™技术，SignalStar™ Multiplex IHC提供一站式解决方案，灵活的Panel设计，即用型抗体检验组合，可以实现在一张切片上检测多达8种靶标。
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如何实现多指标检测？与TSA不同，SignalStar™使用另外一种思路实现多指标检测，主要依赖于使用特别的SingnalStar™抗体实现。SignalStar™抗体带有一段特殊的寡核苷酸标签，加入所有的抗体孵育之后，先加入4个带有互补寡核苷酸标签的荧光基团进行第一轮检测，然后把荧光基团洗脱掉，再加另外4个荧光基团进行第二轮检测，从而实现单个切片最多8个指标检测。
SignalStar™抗体上带有特殊的寡核苷酸标签
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操作是否复杂？
和TSA相比，SignalStar™技术只需进行两轮染色，步骤更加简便。使用CST SignalStar™试剂盒可以完成所有的实验，按照说明书操作即可，无需重新摸索条件和进行抗体的优化验证。
SignalStar™实验流程
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可以检测多少种指标？
在一张切片上最多实现8个指标检测。
技术优势？
SignalStar™ 技术通过优化实验步骤，简化了多重染色过程，使研究人员能够快速获得实验结果。FFPE组织样本只需做一次抗原修复，一次性加入所有抗体，进行两轮荧光检测试剂标记，经两轮拍照，轻松实现2天内检测多达8个指标。
1、开箱即用：试剂盒提供抗体组合，缓冲液试剂和完整实验步骤说明书，无需进行抗体验证及条件摸索；
2、省时省力：2天内可实现检测多达8个指标；
3、性能稳定：SignalStar™ 技术进行充分的内部验证，具有良好的灵活性和可重复性，信号放大系统拥有更大的动态范围，染色不会破坏组织形态结构，轻松实现不同丰度靶标的稳定检测。
