细胞培养中不容忽视的细节汇总

PART01 血清

Q1：请问细胞如何更换血清?
A1：建议梯度替换，以血清为例：完全培养基配置过程中先用25%新血清与75%原血清进行混合，培养传代1-2次；而后用50%新血清与50%原血清混合培养传代；再用75%新血清与25%原血清混合培养传代；最后完全使用新血清培养传代。
Q2：什么时候需要热灭活血清？
A2：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养胚胎干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。如果实验对于补体有要求，则必须进行热灭活，其他情况没有必要。
Q3：血清在细胞培养中的使用量一般是多少？
A3：血清是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5－20％，最常用是10％。过多血清容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。 采购血清时，最好先从供应商处索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量，直至用另一批经过预先试验的样品代替。
Q4：如何保存血清？
A4：需长期保存的血清必须储存于-10℃或更低温冰箱中，研究表明储存在-80℃下的血清在性能方面没有任何变化，但解冻时巨大的温差会导致更多沉淀的产生。血清在4℃冰箱存放时间切勿超过1个月。若一次无法用完1瓶，建议分装后保存，避免反复冻融，另血清结冰体积会增加约10%，需预留一定的体积空间。

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PART02 培养基

Q1：培养基开封后放在冰箱能放多久？如果出现析出还能用吗？
A1：如果培养基被恰当保存，理论上效期内都能使用，但建议培养基开封后在一个月内用完，长期与外界环境接触容易引入污染。配成完全培养基的培养基尽量在2周内用完，双抗、因子等在溶液中时间久了会降解，影响完全培养基性能。培养基有析出首先要排查是否污染，如果是无机盐析出，温度升高后会复溶。可以使用前再次过滤，或者为了更好保护细胞，重新使用新的。
Q2： 为什么培养基用一段时间后，颜色偏紫？还能继续使用吗？
A2：培养基随着多次开盖会使培养液CO2 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性从而变紫，尤其是剩余的培养基越少越容易变紫。可将培养瓶瓶盖旋松放入二氧化碳培养箱校正溶液PH值，过一段时间就会变回正常。变紫的培养基是可以继续使用的，培养细胞时在培养箱会自动恢复颜色。

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PART03 胰酶

Q1：使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
A1：二价离子会抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持胰蛋白酶的活性。

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PART04 实验操作

Q1：细胞培养过程中用到的试剂打开后盖子应该怎么放呢？
A1：针对特别干净的细胞房（生物安全柜），盖子口朝下放置在工作区域；常规实验室，盖子口朝上，同时要注意手不能从上面经过，以防污染。
Q2：细胞铺板的密度需要参考哪些因素确定？
A2：细胞铺板时的密度取决于实验的具体要求和细胞类型，但有一些常见的指导原则。在实际操作中，细胞铺板的密度还应考虑以下因素：1）细胞的生长速率和倍增时间；2）细胞的大小和形态；3）实验的持续时间以及实验目的；4）培养基的类型和更换频率；5）细胞培养板的孔径。