【小优细节君】坏死性凋亡之MLKL检测经验分享

坏死性凋亡（Necroptosis）也称为程序性坏死，是宿主防御某些病原体入侵的把关系统，它是一种程序性裂解细胞死亡的途径。坏死性凋亡在肿瘤发生和转移中起重要作用，坏死性凋亡的失调也是许多炎症性疾病的关键因素。

发生坏死性凋亡的细胞会出现炎症反应和细胞器损伤，它兼具细胞凋亡的调控性和细胞坏死的炎症性。
 

 图1 发生坏死性凋亡的细胞结构示意图
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相关研究必定离不开坏死性凋亡的执行者——MLKL，小优细节君今天就和大家一起来学习MLKL及其在WB检测时的注意要点。

首先小优细节君给大家简单介绍一下MLKL的基本信息和蛋白结构。

MLKL（Mixed lineage kinase domain-like protein，混合谱系激酶结构域样蛋白）属于蛋白激酶超家族，包含一个无催化活性的蛋白激酶样结构域，是一种假激酶。

 

图2 MLKL结构示意图
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MLKL的功能发挥涉及到其与LKL包含一个四螺旋束（4HB）结构域和一个假激酶结构域，该 4HBD 由支撑区域 （BR） 与 C 末端无活性 KLD 融合，这些结构域参与其寡聚化和活化过程。

细胞膜的相互作用。MLKL与细胞膜相互作用的分子动力学机制中，MLKL从水溶液结合到磷脂膜后，螺旋H4区域首先锚定在磷脂膜上，在支架螺旋H6与4HB结构域分离后，4HB结构域才嵌入到磷脂膜中。

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MLKL定位于细胞质，在发生坏死性凋亡时异位至质膜。

建议在离心细胞之前用35%-40%的功率冰浴超声细胞5'*3次，目的是通过断裂染色质，提高蛋白的可溶性，帮助彻底裂解样本，暴露抗原表位。特别是在制备用于检测磷酸化MLKL的样本时，更需要超声。如没有超声仪，可用1ml注射器针头，冰上反复抽打裂解液10次左右，达到类似于超声的效果。降低蛋白粘度，增加蛋白溶解度。

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MLKL的理论分子量约54kDa，若在约150kDa大小位置也检测到条带，那大概率是MLKL被激活时形成的同源三聚体。

使用loading buffer准备WB样品时，请确保样品最终含有5%β-ME或者足量的DTT(40mM)，95～100度煮样5min，让蛋白充分变性。

如果想要更准确的检测三聚体，可以采用非还原电泳体系，同时在制样时避免加入还原剂。
 

图3 非还原电泳检测MLKL
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MLKL是TNF（肿瘤坏死因子）诱导的坏死性凋亡过程中的关键靶标，它作为RIPK1和RIPK3下游的效应蛋白发挥作用。RIPK3在Ser227位点被磷酸化，此磷酸化为MLKL激活所必需。MLKL的激活导致MLKL从细胞质到不同细胞膜的构象开关和易位，在质膜上使得膜丧失完整性，并最终导致坏死性凋亡。
MLKL与RIPK3的相互作用具有物种特异性，人类MLKL仅与人类RIPK3相互作用。
 

图4 坏死性凋亡经典通路的作用机制
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各种胞外或胞内信号直接或通过RIPK1激活RIPK3，RIPK3和MLKL是坏死性凋亡的重要组成部分。

p-MLKL是坏死性凋亡的触发因素，不存在于正常组织、细胞中，它只能在感染、细胞受损或老化组织中检测到。

若研究的是TNF诱导的经典途径，一般需要同步检测RIP激酶家族成员的磷酸化水平。

同时还需要注意TNF诱导也有可能激活凋亡和焦亡的通路，可以通过其他方式（如形态学观察、其他通路关键蛋白的检测等）来辅助确认激活的究竟是哪条通路。
很多时候，大家已经通过优化调整实验条件进行了问题排查却没能找到改善方案，小优细节君有一妙计，此时不如考虑增加一组阳性对照进行对比。

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经典的阳性对照用的是TSZ，具体为Z-VAD （20 uM）30分钟，然后是 hTNF- a （20 ng/ml） + SM-164 （100 nM）7小时。
检测上游的RIP激酶也可参考，时间和剂量需要根据细胞和目的蛋白进行调整。
 

图5 CST #18640例图
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Z-VAD-FMK，它是一种可穿透细胞膜的泛Caspase抑制剂，可与caspase的催化活性部位发生不可逆结合，抑制细胞凋亡。
最后，小优细节君再和大家一起复习一下坏死性凋亡通路：

死亡受体激活（如TNF受体）→RIPK1激活并与RIPK3结合形成坏死小体→RIPK3磷酸化MLKL→MLKL转位至细胞膜并形成孔道→细胞膜破裂和细胞内容物泄露→坏死性凋亡（炎症反应）

阳性对照TSZ处理请牢牢记住哦~

 

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参考资料：
 Murphy JM, Czabotar PE, Hildebrand JM, et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 2013;39(3):443-453. doi:10.1016/j.immuni.2013.06.018IF: 25.5 B1
Sarhan J, Liu BC, Muendlein HI, et al. Constitutive interferon signaling maintains critical threshold of MLKL expression to license necroptosis. Cell Death Differ. 2019;26(2):332-347. doi:10.1038/s41418-018-0122-7IF: 13.7 B1IF: 13.7 B1
Sun L, Wang H, Wang Z, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-227. doi:10.1016/j.cell.2011.11.031

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