首页 /  文章专题

【小优细节君】P-STAT1怎么做出理想的WB条带?

STATs,全称信号转导和转录激活蛋白(Signal transducer and activator of transcription proteins),既是细胞质中的信号转导子,又是细胞核中的转录激活子。目前,已知有七种类型的STAT蛋白。它们参与不同的生物学过程,如免疫、细胞分裂、细胞死亡和肿瘤形成。STAT1是细胞对干扰素(IFN)反应的主要介质。研究者破坏细胞和小鼠的STAT1基因后,观察到它们对IFN的刺激不再反应,而对其它细胞因子的仍旧保持反应,以此判断STAT1对IFN途径具有特异性。它通过在细胞核中转导I型IFN(IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω)、II型IFNγ和III型IFNλ的信号,在对抗病毒和分枝杆菌的免疫反应中发挥关键作用。

STAT1由六个不同的区域组成:(1)螺旋N-末端结构域(ND),它对DNA上相邻STAT二聚体之间的相互作用很重要;(2)与调节蛋白相互作用的卷曲线圈(CC)结构域;(3)用于识别靶基因的特异性DNA序列的DNA结合域(DBD);(4)参与核输出和DNA结合的螺旋连接体(LK)结构域;(5)用于受体结合和二聚化的Src同源性2(SH2)结构域;(6)C末端反式激活结构域(TAD),其包含在转录激活时被磷酸化的特定残基。

图1 STAT1的序列
△点击放大图片

STAT1与STAT家族成员的激活方式相似,都是通过一类与IFN受体相关的非受体酪氨酸激酶Janus激酶(JAKs和TYK2)在细胞质内的酪氨酸磷酸化而被激活。IFN刺激后,磷酸化STAT1分子通过pTyr701-SH2相互作用二聚化。STAT1二聚体向细胞核转移,在细胞核中它们激活基因转录。
 

图2 STAT的激活
△点击放大图片

STAT1的激活需要Y701S727的磷酸化以及氨基末端精氨酸的甲基化。STAT1精氨酸甲基化的抑制或STAT1 Arg-31的突变导致STAT1酪氨酸磷酸化的半衰期延长,所以大家在研究STAT1功能的时候一般要先检测Y701和S727的磷酸化。多种细胞因子,包括IFN-α、IFN-γ、PDGF和EGF都可以刺激这两个位点的磷酸化。例如,EGF处理后,JAK1、JAK2或TYK2刺激Tyr-701的磷酸化促进二聚化和随后向细胞核的易位。MAPK14、ERK1/2、CAMK2/CAMKII和CK2在内的几种激酶对Ser-727的磷酸化尤为重要。

我们在检测p-STAT1,尤其是p-STAT1(Tyr701)的时候,没有信号或者条带不好看,应该怎么办呢?

1
检测Total STAT1

虽然STAT1分布非常广泛,在各种组织和细胞中都有表达,但是相对表达量仍然有高低之分,下图可以看到,相同的上样量,在HEK-293T细胞中检测到的STAT1非常弱。如果STAT1大部分在核内,样本提取的难度增加。STAT1有两种由其转录物的选择性剪接产生的亚型:STAT1α(91kDa)和STAT1β(84kDa)。STAT1α由750个氨基酸组成,是STAT1的主要形式。STAT1β是一种短型,由712个氨基酸组成。STAT1α在位于TAD的酪氨酸701(Y701)和丝氨酸727(S727)残基上有两个磷酸化位点,而STAT1β缺乏部分TAD,仅包含Y701磷酸化位点。从total STAT1着手,先确定样本中是否可以同时检测到STAT1α和STAT1β,确认了研究对象以后才能应用正确的模型和方法
 

图3 STAT1在不同细胞的表达情况:1. HeLa细胞;2. HEK-293T;3. MCF7。上样量20ug/孔
△点击放大图片


 

图4 HPA中STAT1表达水平,与上图WB结果一致
△点击放大图片

2
选择合适的取样时间

有研究表明,在IFN-β处理的细胞中,10分钟和30分钟内,STAT1在Tyr-701和Ser-727处磷酸化。相反,STAT1 Ser-708磷酸化在16小时后首次被检测到,并在24小时后达到峰值,Tyr-701磷酸化已经大幅递减。这可能是由于Ser-708磷酸化需要Tyr-701的去磷酸化和CRM1介导的STAT1入核。研究者也分别用IFN-γ、IFN-λ处理细胞,随着时间的推移, STAT1磷酸化水平呈现不同的变化。

当检测的磷酸化位点不同时,应用不同的药物,应设置不同的取样时间,最好是短时间内多次取样。
 

图5 IFN-β处理的纤维肉瘤细胞中Stat1激活情况
△点击放大图片

3
样本提取方法

分布于细胞核内的STAT1要怎样检测更方便呢?除了使用裂解能力较强的RIPA,制备样本时超声处理是很好的选择。超声条件是10-15s,3 次(期间每次间隔10s),超声频率是30%-40%,电流30A;  如果没有超声仪,可以用1ml 带针头注的射器冰上反复抽吸10-15 次,直到裂解液澄清好吸为止。或者使用试剂盒提取胞核部分进行检测。

参考文献:
 1. Manlio Tolomeo, Andrea Cavalli, Antonio Cascio. STAT1 and Its Crucial Role in the Control of Viral Infections. Int. J. Mol. Sci. (2022)23: 4095.
2. J E Durbin 1,R Hackenmiller,M C Simon,et al. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. (1996)84: 443-450.
3. Olivia Perwitasari, Hyelim Cho, Michael S,et al. Inhibitor of κB Kinase ε (IKKε), STAT1, and IFIT2 Proteins Define Novel Innate Immune Effector Pathway against West Nile Virus Infection. (2011)286(52): 44412–44423

部分相关产品:

产品名称 货号
Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb 14994S
Stat1 (D4Y6Z) Rabbit mAb 14995S
Stat1 Antibody 9172S
Stat1 (42H3) Rabbit mAb 9175S
Phospho-Stat1 (Tyr701) (58D6) Rabbit mAb 9167S
Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb 7649S
Phospho-Stat1 (Ser727) (D3B7) Rabbit mAb 8826S
Phospho-Stat1 (Ser727) Antibody 9177S
Stat1 抗体 (C-136) sc-464
Stat1 抗体 (C-111): sc-417
Stat1 抗体 (B-9) sc-271661
Stat1 抗体 (H-1) sc-398524
p-Stat1 抗体 (A-2) sc-8394
p-Stat1 抗体 (pY701.4A) sc-136229
p-Stat1 抗体 (PSM1) sc-51700
p-Stat1 抗体 (12C5) sc-81522
细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒 abs9346-50T

推荐阅读:
【小优细节君】偶遇Caspase提问器
【小优细节君】 炎症小体NLRP3如何做好?