【小优细节君】P-STAT1怎么做出理想的WB条带？

STATs，全称信号转导和转录激活蛋白（Signal transducer and activator of transcription proteins），既是细胞质中的信号转导子，又是细胞核中的转录激活子。目前，已知有七种类型的STAT蛋白。它们参与不同的生物学过程，如免疫、细胞分裂、细胞死亡和肿瘤形成。STAT1是细胞对干扰素（IFN）反应的主要介质。研究者破坏细胞和小鼠的STAT1基因后，观察到它们对IFN的刺激不再反应，而对其它细胞因子的仍旧保持反应，以此判断STAT1对IFN途径具有特异性。它通过在细胞核中转导I型IFN（IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω）、II型IFNγ和III型IFNλ的信号，在对抗病毒和分枝杆菌的免疫反应中发挥关键作用。

STAT1由六个不同的区域组成：（1）螺旋N-末端结构域（ND），它对DNA上相邻STAT二聚体之间的相互作用很重要；（2）与调节蛋白相互作用的卷曲线圈（CC）结构域；（3）用于识别靶基因的特异性DNA序列的DNA结合域（DBD）；（4）参与核输出和DNA结合的螺旋连接体（LK）结构域；（5）用于受体结合和二聚化的Src同源性2（SH2）结构域；（6）C末端反式激活结构域（TAD），其包含在转录激活时被磷酸化的特定残基。

图1 STAT1的序列
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STAT1与STAT家族成员的激活方式相似，都是通过一类与IFN受体相关的非受体酪氨酸激酶Janus激酶（JAKs和TYK2）在细胞质内的酪氨酸磷酸化而被激活。IFN刺激后，磷酸化STAT1分子通过pTyr701-SH2相互作用二聚化。STAT1二聚体向细胞核转移，在细胞核中它们激活基因转录。
 

图2 STAT的激活
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STAT1的激活需要Y701和S727的磷酸化以及氨基末端精氨酸的甲基化。STAT1精氨酸甲基化的抑制或STAT1 Arg-31的突变导致STAT1酪氨酸磷酸化的半衰期延长，所以大家在研究STAT1功能的时候一般要先检测Y701和S727的磷酸化。多种细胞因子，包括IFN-α、IFN-γ、PDGF和EGF都可以刺激这两个位点的磷酸化。例如，EGF处理后，JAK1、JAK2或TYK2刺激Tyr-701的磷酸化促进二聚化和随后向细胞核的易位。MAPK14、ERK1/2、CAMK2/CAMKII和CK2在内的几种激酶对Ser-727的磷酸化尤为重要。

我们在检测p-STAT1，尤其是p-STAT1（Tyr701）的时候，没有信号或者条带不好看，应该怎么办呢？

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检测Total STAT1

虽然STAT1分布非常广泛，在各种组织和细胞中都有表达，但是相对表达量仍然有高低之分，下图可以看到，相同的上样量，在HEK-293T细胞中检测到的STAT1非常弱。如果STAT1大部分在核内，样本提取的难度增加。STAT1有两种由其转录物的选择性剪接产生的亚型：STAT1α（91kDa）和STAT1β（84kDa）。STAT1α由750个氨基酸组成，是STAT1的主要形式。STAT1β是一种短型，由712个氨基酸组成。STAT1α在位于TAD的酪氨酸701（Y701）和丝氨酸727（S727）残基上有两个磷酸化位点，而STAT1β缺乏部分TAD，仅包含Y701磷酸化位点。从total STAT1着手，先确定样本中是否可以同时检测到STAT1α和STAT1β，确认了研究对象以后才能应用正确的模型和方法。
 

图3 STAT1在不同细胞的表达情况：1. HeLa细胞；2. HEK-293T；3. MCF7。上样量20ug/孔
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图4 HPA中STAT1表达水平，与上图WB结果一致
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选择合适的取样时间

有研究表明，在IFN-β处理的细胞中，10分钟和30分钟内，STAT1在Tyr-701和Ser-727处磷酸化。相反，STAT1 Ser-708磷酸化在16小时后首次被检测到，并在24小时后达到峰值，Tyr-701磷酸化已经大幅递减。这可能是由于Ser-708磷酸化需要Tyr-701的去磷酸化和CRM1介导的STAT1入核。研究者也分别用IFN-γ、IFN-λ处理细胞，随着时间的推移， STAT1磷酸化水平呈现不同的变化。

当检测的磷酸化位点不同时，应用不同的药物，应设置不同的取样时间，最好是短时间内多次取样。
 

图5 IFN-β处理的纤维肉瘤细胞中Stat1激活情况
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样本提取方法

分布于细胞核内的STAT1要怎样检测更方便呢？除了使用裂解能力较强的RIPA，制备样本时超声处理是很好的选择。超声条件是10-15s，3 次(期间每次间隔10s)，超声频率是30%－40%，电流30A;  如果没有超声仪，可以用1ml 带针头注的射器冰上反复抽吸10-15 次，直到裂解液澄清好吸为止。或者使用试剂盒提取胞核部分进行检测。

参考文献：
 1. Manlio Tolomeo， Andrea Cavalli， Antonio Cascio. STAT1 and Its Crucial Role in the Control of Viral Infections. Int. J. Mol. Sci. （2022）23: 4095.
2. J E Durbin 1，R Hackenmiller，M C Simon，et al. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. (1996)84: 443-450.
3. Olivia Perwitasari, Hyelim Cho, Michael S，et al. Inhibitor of κB Kinase ε (IKKε), STAT1, and IFIT2 Proteins Define Novel Innate Immune Effector Pathway against West Nile Virus Infection. （2011）286(52): 44412–44423

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