【小优细节君】 炎症小体NLRP3如何做好？

引言
炎症反应（inflammation）是细胞对微生物感染、外界刺激以及自身组织损伤做出的复杂生物学反应，包括疼痛，发热，发红，发肿以及组织功能受损等一系列症状。
如果你要深入研究验证，那一定绕不开炎症小体。
关于炎症小体，我们在之前的文章中有详细介绍过，还列举了一些疾病中它们是如何发挥作用的。
大部分炎症小体的基础结构都是以NLR或ALR蛋白家族作为受体蛋白(receptor)、ASC作为接头蛋白(adaptor)、caspase作为效应蛋白(effector)。
 

炎症小体结构示意图

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目前研究较多的是NLRP3炎症小体。
NLRP3炎症小体由ASC、Caspase-1和NLRP3组成。NLRP3炎症小体蛋白质结构可表示为：LRR-NACHT-PYD : PYD-CARD : CARD-Caspase。
在研究检测NLRP3时，我们需要提前做好哪些功课，避开雷区，比较快的得到正确客观的结果呢？小优整理了以下三点：

01 NLRP3激活途径
 

NLRP3的典型途径 — 炎症小体激活

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炎症小体激活经典途径描述了巨噬细胞中 NLRP3 的激活，其中需要两种刺激。
 

在静息状态下，NLRP3 和 IL-1β 在细胞中表达量处于极低水平，不能用于组装或活化 NLRP3 炎症小体。
免疫细胞需要接受引发刺激，如脂多糖（LPS）与胞膜上的Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）结合以激活NF-κB，活化的NF-κB进一步上调NLRP3、pro-IL-1β的mRNA转录水平。
高水平的NLRP3、pro-IL-1β mRNA是形成有效炎症小体的关键，所以我们在碰到WB无条带的时候，也可以通过mRNA来确定NLRP3、pro-IL-1β的表达量。
 

接受启动信号后,NLRP3炎症小体会因病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)等多种因素而被激活。
NLRP3结构蛋白的寡聚化作用使其与接头蛋白ASC的PYD相结合，然后ASC的CARD与pro-Caspase-1上的CARD结合，形成完整且有活性的NLRP3炎性小体，促使pro-Caspase-1自我裂解，产生活性的效应蛋白Caspase-1。
Caspase-1具有剪切GSDMD的功能，使GSDMD的N末端结构域释放。N-GSDMD通过与细胞膜上内页的磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇结合，在细胞膜上打孔，细胞内外失衡而破裂，引起细胞死亡，细胞内容物释放到细胞外，引起炎症反应。
Caspase除了剪切GSDMD，还可以诱导IL-1β和IL-18从未成熟状态转化为活性状态，细胞死亡后IL-1β和IL-18会释放到细胞外从而诱发神经炎症。
ASC、caspase-1的剪切，IL-1β和IL-18的剪切，以及GSDMD的剪切，这些结果都可以帮助我们判断NLRP3炎症小体的激活情况。
 

doi: 10.1038/s41419-021-03751-3.

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以这篇文献为例，作者通过对肾小管上皮细胞HK-2进行H/R 模型研究，得出结论：氧化应激上调的 FIP1 通过诱导 3'UTR 缩短来放大炎症、纤维化、ROS 产生和细胞凋亡。
 

FIP1 促进肾小管上皮细胞的炎症（文献 Fig 5）

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02 NLRP3激活途径
前面我们提到NLRP3在静息细胞中表达量很低，那是不是未刺激的细胞就无法检测到WB条带呢？答案是否定的。
从HPA（The Human protein Atlas）可知NLRP3在血液和免疫细胞中的基因表达水平尚可，富集于巨噬细胞、库普弗细胞、霍夫鲍尔细胞，但NLRP3多以泛素化无活性、稳定状态存在，实际蛋白水平并不高。
 

NLRP3在人源细胞系中的基因表达水平（HPA）

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从BioGPS可知NLRP3在鼠源细胞系中主要在血液和免疫细胞上表达，并可通过适当的刺激处理（如LPS）提高其表达量。
 

NLRP3在鼠源细胞系中的基因表达水平（BioGPS）

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NLRP3在树突细胞、单核细胞和巨噬细胞中的表达较高水平，样本选择时首先需要了解它的表达情况。若蛋白本身不表达或表达量极低，刺激处理也未必能有效提高表达水平，如何才能有效激活也需要多参考文献中的条件设置。
 

不同样本及不同处理NLRP3的蛋白表达情况

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03 WB常见问题的优化方案
在做Western实验时，有的老师可能会遇到无条带、非特异带、高背景或者条带位置不对的情况，针对这些情况出现的可能原因，小优进行了一一分析，并给出了相应的解决方案。

常见问题原因分析
NO.1 无条带：
样品未经合适处理；提取不充分；抗体不工作
 

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NO.2 非特异带：
样品降解；漂洗不充分；抗体非特异
 

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NO.3 高背景：
样品降解；试剂或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗体非特异
 

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NO.4 条带位置不对：
样品降解，胶浓度，抗体非特异
 

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如何才能得到一个漂亮的结果呢？小优为您提供了一些优化建议：

01 无条带
设置阳性对照（如小鼠骨髓源性的DC、骨髓源性的巨噬细胞等）；样品新鲜制备；裂解时建议超声处理；增加上样量(细胞20μg，组织50-100μg)；更换抗体。

02 非特异性条带
新鲜制备样品；加强漂洗，增加漂洗液中的NaCl 浓度（150mM-500mM）和Tween浓度（0.1-0.5%）；更换抗体。

03 高背景
新鲜制备样品；实验中试剂包括电泳液、转膜液、漂洗液、脱脂奶粉、抗体稀释液等用新鲜配制的，使用干净的海绵、新的滤纸，操作时用镊子夹边缘不要用手触摸，孵育时放平、均匀孵育，保持膜的湿润；加强漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween浓度；换用NC膜；更换抗体。

04 条带位置不对
新鲜制备样品；使用梯度胶，排查问题时孵全膜；更换抗体。

小优Tips
裂解后对细胞或组织进行超声，目的在于确保膜的充分剪切，并通过断裂染色质，提高蛋白的可溶性，帮助彻底裂解样本，减少拖带。
超声步骤为冰上3 X 5 second bursts at 50% output。如没有超声仪，可用1ml注射器针头，冰上反复抽打裂解液10次左右，达到类似于超声的效果。

 

裂解物超声效果

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参考文献：
Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases
The NLRP3–inflammasome as a sensor of organelle dysfunction
The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics
Inflammasomes and Their Roles in Health and Disease
Alternative polyadenylation trans-factor FIP1 exacerbates UUO/IRI-induced kidney injury and contributes to AKI-CKD transition via ROS-NLRP3 axis
https://www.proteinatlas.org/ENSG00000162711-NLRP3/celltype
http://biogps.org/#goto=genereport&id=216799