分分钟get泛素化研究前沿

蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰（PTMs）是指蛋白质翻译后的化学修饰，几乎参与细胞所有的生命活动过程，并发挥着重要的调控作用。研究表明，蛋白质翻译后修饰的过程极其复杂，已知的翻译后修饰种类有20多种。但其中较为常见的主要是磷酸化、泛素化、酰（含乙酰）化、甲基化以及糖基化。小优也把最近十年，各种翻译后修饰的相关文章做了简单的统计。
 

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从上表也可以看出，泛素化是近十年PTMs中研究的热点。2004年，Ciechanover,Hershko和 Rose因发现泛素介导的蛋白质降解共同获得诺贝尔化学奖。近十年来Ubiquitination相关文章也是日益增多。中国生物化学与分子生物学会2019年会“蛋白质功能与修饰”专题进行修饰学术分享的老师，九成涉及泛素化！由此可见，泛素化具有广阔的应用前景。
 

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泛素化是指泛素(一类低分子量的蛋白质)分子在一系列特殊酶的作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。这些特殊的酶包括泛素激活酶，结合酶、连结酶和降解酶等。泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。
虽然泛素化研究方法和思路多样，但认真总结还是能发现其中的规律所在，今天小优筛选了2019年的部分高分文章，经过数个不眠之夜的精细研读，整理出来l科研思路，与大家一同分享！
拟南芥蛋白质K63多泛素化修饰网络
法国巴黎-萨克雷大学Grégory Vert团队
 

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根据所添加泛素分子数目的不同，泛素化修饰分为单泛素化修饰和多泛素化修饰；多泛素化修饰又可根据所连接的赖氨酸位置不同分为K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63等类型。酵母和动物中的研究表明K63类型的多泛素化修饰通常导致膜蛋白的内吞，DNA损伤响应，细胞自噬，信号传导等过程。对于植物K63类型多泛素化发生机制以及对于生长发育的影响还知之不多。
2019年11月8日，Grégory Vert教授团队在Plant Cell上发文，利用转录组，蛋白互作组及蛋白质组等方法，确认拟南芥K63多泛素修饰依赖于E2 UBC35/36，构建了拟南芥K63多泛素修饰的网络。同时，揭示了K63多泛素修饰通过调控生物及非生物胁迫响应、物质代谢、微管运输、跨膜转运、细胞核转运蛋白、染色体结构、RNA剪切等过程影响拟南芥的生长发育。研究思路如下：
   
表型发现
基于动物中K63多泛素化修饰依赖于E2 UBC13，研究者将拟南芥UBC13的两个同源基因UBC35和UBC36同时突变后，K63多泛素化修饰消失，植株发育受到显著影响。利用转录组分析发现在UBC35/36敲低的植物中与生物及非生物胁迫相关的基因显著上调而与芥子油苷代谢，细胞周期，微管运动及RNA加工相关的基因显著下调。
   
功能及机制研究
利用酵母双杂交进行互作蛋白筛选。GFP融合蛋白进行定位追踪和免疫沉淀，经质谱分析鉴定到约400个含有K63多泛素修饰的蛋白。将部分该方法鉴定到的底物蛋白接上GFP标签稳定转化到拟南芥或瞬时表达于烟草叶肉细胞。然后利用GFP抗体进行免疫沉淀，并用K63多泛素特异抗体进行Western Blot检测，的确检测到在这些蛋白上存在K63多泛素修饰。
 

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多泛素化蛋白的验证结果图。将鉴定到的部分底物蛋白接上GFP标签稳定转化到拟南芥或瞬时表达于烟草叶肉细胞，检测到在这些蛋白上存在K63多泛素修饰。

部分抗体产品总结

去泛素酶特异性炎症信号的发现
浙江大学朱永群团队
 

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线性泛素链参与宿主免疫防御过程，具有很强的抑制细菌侵染的能力，所以在病原菌领域里长期以来存在着一个科学疑问：是否存在特异地切割线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白分子。2019年5月20日，朱永群实验室在Nature Microbiology发文，首次发现一个特异地切割线性泛素链的全新去泛素化酶，解决了病原菌领域的一个长期科学问题，发现了病原菌抑制宿主NF-κB免疫信号通路和泛素化信号通路的一个新机制，以及揭示了军团菌属病原菌一个普适的胞内生存机制。另外，该研究所建立的筛选体系将帮助人们发现更多的病原菌去泛素化酶。由于与真核去泛素化酶完全不同，RavD可以被开发成研究线性泛素链的全新研究工具，促进真核细胞信号转导的研究。研究思路如下：
表型发现
该团队设计一个针对病原菌的去泛素化酶活性筛选实验体系，对43种不同病原菌进行了广泛的筛选，成功地发现嗜肺军团菌裂解液具有切割线性泛素链的活性，表明嗜肺军团菌可能含有切割线性泛素链去泛素化酶活性的效应蛋白分子。再从嗜肺军团菌中克隆149个功能未知的效应蛋白，利用293T细胞对其进行表达。纯化表达后的效应蛋白，在体外进行去泛素酶活性实验，成功筛选出唯一的一个名为RavD效应蛋白，能够切割线性泛素链。进一步实验发现，从大肠杆菌重组表达的RavD也能够在体外水解线性泛素链。
   
功能检测
293T细胞内过表达RavD能够完全抑制细胞内线性泛素链的形成，抑制线性泛素链介导的信号转导。将ravD基因敲除后，嗜肺军团菌就完全丧失了切割线性泛素链的能力。后续实验表明，RavD只特异地切割线性泛素链，不能切割任何异肽键连接形式的泛素链，揭示了RavD是一个特异切割线性泛素链的去泛素化酶。
   
机制研究
进一步结构解析发现，RavD具有独特的Cys-His-Ser催化三联体基序，其三维结构是一个全新的去泛素化酶，对线性泛素链进行特异的识别。突变催化氨基酸残基或者线性泛素链识别的氨基酸残基都完全破坏了RavD对线性泛素链的切割能力。RavD利用其C末端和N末端结构特异性，达到抑制宿主NF-κB免疫信号的目的。RavD广泛地存在于军团菌属细菌中，其同源蛋白也都具有切割线性泛素链的去泛素化酶活性，表明切割线性泛素链是军团菌属细菌在宿主细胞内生存的一个普遍机制。
 

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RavD作用机制模式图。a. RavD水解线性泛素链的酶学活性示意图。b. RavD在嗜肺军团菌感染过程中的作用机制模式图。RavD被四型分泌系统分泌后，在宿主巨噬细胞内定位到嗜肺军团菌膜泡结构上，清楚膜泡上的线性泛素链，抑制宿主NF-κB免疫通路。

部分抗体产品总结

谷氨酸依赖泛素连接酶的磷酸化调节 
罗招庆/欧阳松教授组合团队
 

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2016年罗招庆教授普渡大学团队在Nature杂志上首次发文“Ubiquitination independent of E1 and E2 enzymes by bacterialeffectors”，报道了SidE家族效应蛋白独立于经典的E1和E2酶的泛素化修饰，2017年罗招庆教授吉林大学团队在Cell Research上发表“A unique deubiquitinase that deconjugates phosphoribosyl-linked protein ubiquitination”发现嗜肺军团菌中的另一个效应蛋白SidJ可调控SdeA等SidE家族成员，但其生化机制尚不清楚。2019年7月22日，Nature杂志在线发表了由美国普渡大学罗招庆教授和福建师范大学欧阳松应教授的联合成果，该研究发现致病性嗜肺军团菌效应蛋白SidJ可以被宿主体内的一个钙调蛋白Calmodulin（简称CaM）结合并激活，进而通过谷氨酸化修饰（Glutamylation）抑制SidE家族泛素连接酶活性的分子机理，临床治疗嗜肺军团菌感染的药物开发提供了新靶点。研究思路如下：
   
表型发现
通过质谱（LC-MS/MS）分析，发现SidJ诱导失活的SdeA发生129.01道尔顿的分子量漂移。进而发现，SidJ能对SdeA进行谷氨酸化修饰，而修饰位点的功能就是为泛素激活提供能量。
   
功能及机制研究
经SidJ序列分析，发现其C端结构域能够与CaM结合形成稳定复合物，进而激活其酶活性谷氨酸化SdeA。结构解析显示CaM能够通过N-lobe和C-lobe与SidJ存在广泛的结合。另外，SidJ-CaM复合体结合一个AMP残基，揭示SidJ是在α位磷酸切割ATP，从而通过酰化单磷酸腺苷化激活被修饰位点的谷氨酸残基，不同于常见的磷酸化激活。同时，在没有SdeA的反应体系里，SidJ能发生AMP自修饰（self-AMPylation），进一步说明该反应由两步特异的修饰完成。在没有受体基团的条件下，SidJ将源于ATP的AMP用于自修饰。综合现有的研究结果，研究人员提出了SidJ结合宿主CaM催化SdeA的谷氨酸化修饰，进而导致SdeA失活的分子机制。
 

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SidJ、 SdeA、CaM、ATP的互相影响以及对 SidE家族成员的抑制作用。
部分抗体产品总结

 
总体分析下来，就是“表型发现—功能验证—机制研究”，涉及的试验方法也大同小异，包括质谱、酵母杂交、载体构建、基因组分析、WB、IP、IF、F、ChIP等，下面小优给您着重介绍下蛋白修饰表型发现的关键技术—PTMScan® 技术和产品，以及优质泛素化抗体产品：
PTMScan® 技术和产品
PTMScan®技术采用Cell Signaling Technology (CST) 的专有方法通过免疫沉淀实现肽富集，这种方法使用一种特殊微珠接合抗体以及液相色谱法 (LC)-质谱法 (MS/MS) 对细胞蛋白中的翻译后修饰 (PTM) 位点进行定量分析。这包括磷酸化 (PhosphoScan®)、泛素化 (UbiScan®)、乙酰化 (AcetylScan®) 和甲基化 (MethylScan®) 等等。PTMScan® 技术能让研究人员分离、鉴定以及定量大量翻译后修饰的细胞肽，具有高特异性和灵敏度，从而可以全面了解细胞和组织样品中的PTM，对这些修饰位点发生于何处不会具有偏好性。
PTMScan® Ubiquitin Remnant Motif（K-ε-GG）Antibody Bead Conjugate 是一种专有泛素分支 (“K-ε-GG”) 抗体，它在胰蛋白酶消化后对蛋白底物上残留的泛素残迹二甘氨酸标签具有特异性，可用于使胰蛋白酶消化细胞样品中的泛素化肽达到富集。富集后，经LC-MS/MS分析可识别数百个到上千个非重复泛素化序列的定量情况。
泛素化修饰高通量筛选试剂盒 
PTMScan® Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit #5562（大包装，可应用于10个样本）
PTMScan® Pilot Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit #14482（小包装，可应用于3个样本）
泛素化修饰抗体
信号通路金标准CST拥有泛素化修饰抗体一抗共9个货号，修饰蛋白包括组蛋白及聚泛素链等，应用包括WB、IP、IF、F、ChIP等，可根据您的需要进行选择，详细信息见下表：