抗病毒药物研发筛选和活性评估

这里小优给大家分析文献案例，解读药物研发不同阶段的解决方案。
抗病毒药物研发思路案例分析

1 靶点发现
相对于未知的药物靶点来说，已知的药物靶点不过是冰山一角。如何能在众多的未知里发现并找到有效的药物靶点？功能基因组学的应用，可以通过系统的RNAi、CRISPR或过表达在动态的生物系统中决定，用于病原体研究，可发现病原体在侵染宿主过程中的关键因素，有助于新靶点的识别用于抗病毒治疗。
例：以人激酶组为靶点，利用siRNA文库筛选影响SARS冠状病毒复制主要因素
蛋白激酶是多种细胞功能调节关键因子，利用RNAi技术，针对包含蛋白激酶相关的779个基因mRNA同时下调表达，并于基因下调表达48h感染SARS冠状病毒（SARS-CoV-GFP）,筛选得出90个具有抗SARS冠状病毒作用的蛋白，和40个促进SARS冠状病毒前体复制蛋白。这些筛选出的关键蛋白因子，经过通路分析同时隶属于一些细胞通路子集如先天免疫应答、代谢等，因此推断在SARS-CoV感染细胞中似乎起着关键作用。并从中选择了两个因素（COPB1和COPB2）进行更广泛深入的验证，帮助SARS冠状病毒侵染宿主过程中新靶点的发现，以及后续的抗病毒治疗。
参考文献：
de Wilde AH, Wannee KF, Scholte FE, et al. A kinome-wide siRNA screen identifies proviral and antiviral host factors in SARS-coronavirus replication, including PKR and early secretory pathway proteins. J Virol. 2015 Aug;89(16):8318-33.
Dharmacon提供RNAi/CRISPR/过表达、以及非编码lncRNA/microRNA调控产品，涵盖人或小鼠种属，全基因组范围或各基因家族范围（可支持定制），如下：
 

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2 高通量药筛
针对病毒药物靶点做高通量药筛，我们主要对病毒生命周期其中的4个阶段做一些文献分享和介绍，HTRF技术可提供的药筛解决方案。
病毒复制循环的六个阶段：
附着、进入、整合、生物合成、装配、释放
 

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附着 attachment
是指：病毒附着于敏感细胞的表面受体，它是感染的起始期。
例：HTRF技术可直接筛选RNA病毒（人鼻病毒HRV）与受体蛋白（上皮粘附因子）附着抑制剂（人源单克隆抗体）
HTRF实验原理图：
 

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考虑到活病毒没有可用的抗体以及直接标记染料的风险，我们在HRV病毒受体ICAM-1上分别做标记，融合蛋白ICAM-1-Fc直接标记能量供体Eu，融合蛋白ICAM-1-FLAG，用Anti-FLAG抗体使其带上能量受体XL665,当ICAM-1-Fc和ICAM-1-FLAG分别结合在HRV不同位点时，能量供体Eu和能量受体XL665靠近产生FRET荧光信号，当加入的抑制剂能有效抑制病毒和受体的结合时，则FRET信号下降！
参考文献：Development of a homogeneous high-throughput screening assay for biological inhibitors of human rhinovirus infection.
文中利用HTRF技术分离出针对上皮细胞粘附因子ICAM-1的高亲和力人源单克隆抗体，该抗体能够抑制HRV与粘附分子ICAM-1的附着结合，并显示出对血清型HRV感染的有效功能性阻断。
部分产品：
 

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整合 integration
是指：病毒体释放基因组整合到宿主基因组中。
例：利用HTRF技术筛选HIV病毒的IN（逆转录病毒整合酶）和LEDGF/p75（细胞辅助因子）相互作用抑制剂以及IN二聚化抑制剂！
逆转录病毒HIV的遗传物质与感染细胞DNA的整合，需要借助逆转录病毒整合酶IN，而IN的功能实现需要细胞辅因子LEDGF（又名p75蛋白）的辅助，如下图所示，因此筛选抑制剂阻断IN和LEDGF/p75相互作用可以达到治疗HIV的目的。
 

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HTRF技术筛选模型：
 

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参考文献：Affinities between the binding partners of the HIV-1 integrase dimer/lens epithelium derived growth factor (IN dimer/LEDGF) complex.
2009年，加利福尼亚州的Gilead Sciences公司研究了HIV-1整合酶（IN）的二聚化以及LEDGF和IN二聚体之间的相互作用，并成功筛选出，LEDGF、MBP-IBD和TPAsCl对该蛋白-蛋白相互作用的抑制效果。其中TPAsCl已被证实能结合至IN二聚体表面上的LEDGF/p75结合口袋，在该研究中测试得到TPAsCl的IC50为400 μM。
部分产品：
 

生物合成 Biosynthesis
是指：病毒核酸复制和蛋白质合成。
例：HTRF技术定量检测RNA病毒
检测病毒感染的传统方法为噬菌斑测定，这通常需要几天的时间。定量PCR也是检测病毒的常用手段。
Cisbio提供的Viral double-stranded RNA detection kit（#64RNAPEG）同样可以用于检测不同类别病毒，帮助用户快速高效地检测细胞裂解物中dsRNA的存在（单链RNA病毒在复制过程中也会生产dsRNA中间体，同样适用于该试剂盒）。该试剂盒的检测原理如下图所示：
 

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产品信息：
 

参考文献：
Development of a homogeneous time-resolved fluorescence assay for detection of viral double-stranded RNA.
2018年，日本麒麟制药用该试剂盒测量了正链单股RNA病毒：人鼻病毒，肠病毒，柯萨奇病毒和鼠诺如病毒在复制过程中产生的dsRNA，并检测了HRV 3C蛋白酶抑制剂的抗病毒活性。在检测感染HRV-B14的H1-HeLa细胞中rupintrivir的抗病毒活性时，其对比了三种方法：HTRF® dsRNA，qPCR和CPE，三种方法测得的EC50分别为3.3 nM，5.1 nM和2.3 nM。此实验结果进一步验证了HTRF® dsRNA测量的可信性。
装配 Assembly
是指：新合成的病毒核酸和结构蛋白在感染细胞内组合成病毒颗粒。
例：利用HTRF技术筛选HCV（丙型肝炎病毒）核心蛋白二聚化的小分子抑制剂
丙型肝炎病毒HCV（结构图如下），由包膜、核衣壳和病毒核心构成。HCV的RNA与衣壳蛋白结合形成核衣壳，这是组装病毒颗粒的第一步。核心蛋白是HCV病毒最保守的蛋白质，它对HCV核衣壳或衣壳的组装十分关键，抑制其二聚化可能是寻找抗HCV药物的有效方法。
 

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HTRF实验模型：
 

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参考文献：A time-resolved fluorescence–resonance energy transfer assay for identifying inhibitors of hepatitis C virus core dimerization.
2010年，作者基于PPI相互作用的实验原理，利用HTRF技术快速高效地从多个化合物库中筛选到了针对HCV核心蛋白二聚化的小分子抑制剂。
以上，是HTRF技术对病毒复制循环其中4个阶段提供药物筛选的解决方案，除了第三个生物合成阶段dsRNA定量检测以外，其他三个阶段的检测模型，都可以定义为PPI（蛋白蛋白相互作用）模型。
2分钟学习HTRF技术在蛋白相互作用研究中的应用
 
 
新冠病毒药物研发启发
多项最新研究表明，ACE-2（血管紧张素转化酶Ⅱ）是此次新型冠状病毒感染的关键分子，2019-nCoV通过Spike蛋白与ACE-2的结合介导进入细胞内部，因此阻断病毒Spike蛋白和人ACE-2的特异性结合是潜在重要的治疗方向之一！
 

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Fig. Spike蛋白与ACE2蛋白互作示意图
(图片来自实验万事屋)
针对S蛋白和ACE-2蛋抑制剂的筛选，同样可以借鉴PPI的模型，利用HTRF技术设计原理如下图：
 

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更多关于HTRF技术在PPI研究中的应用，点击链接：http://www.univ-bio.com/video_cat.php?id=16

产品信息：

爱必信生物可提供诸多文献报道抗病毒肺炎药物的临床实验及治疗药物的科研级化合物，产品信息如下：
 

3 药物功能性评价
新冠病毒涉及细胞因子风暴检测，目前市面可以提供检测平台有很多，比如：Luminex、CBA、抗体芯片、以及MSD技术，目前优宁维Labex可提供这四大检测平台！各技术介绍和优势总结，详见
新型冠状病毒与细胞因子风暴
抗病毒药物研发的药物代谢动力学研究（测定临床前和临床血液样本中的抗体药浓度）和免疫原性ADA检测，小优推荐一款高通量，超灵敏，实验简单的技术—MSD电化学发光技术。

MSD在药物代谢动力学研究中应用

案例：使用MSD技术，检测了埃博拉疗法3种抗体的血药浓度，有效提高传染病样品检测的检测效率。
REGN-EB3（也称为REGN3470-3471-3479）是再生元利用VelociSuite技术发明的抗埃博拉疗法，该疗法结合了三种全人单克隆抗体，此前已获得美国FDA和欧洲EMA的孤儿药认定在感染埃博拉病毒后早期寻求治疗、血液中病毒水平较低的41%的试验参与者中，REGN-EB3抗体组的死亡率降至6%。柳叶刀子刊报道了REGN-EB3药物的血药浓度检测方案，使用MSD（Meso Scale Discovery）多重检测技术，检测了3种抗体的血药浓度，有效提高了传染病样品检测的检测效率。
参考文献：Safety, pharmacokinetics, and immunogenicity of a co-formulated cocktail of three human monoclonal antibodies targeting Ebola virus glycoprotein in healthy adults: a randomised, first-in-human phase 1 study，2018，The Lancet infectious diseases.
除了血药浓度的多重检测，MSD技术在多类抗病毒药物研究的药物毒理及疗效评估领域都大有可为，全球多个实验室采用MSD成品试剂盒检测血清血浆、脑脊液、尿液等多种类型样本中biomarker，测定抗体药机体反应，评估抗体药疗效及毒理作用。

全球抗体药免疫原性评估金标准-MSD

在生物医药品的开发中，免疫原性的评价是必须的。如果产生对给药制剂的抗体，不仅药理活性消失，还可能引起安全性上的问题，因此进行免疫原性检测是非常重要的。在2008年4月实施的欧洲医药品安全厅(EMEA)的指导方针中，为了进行免疫原性评价，实施了电化学发光(ECL)方法。
参考文献：Guidance on Immunogenicity Assessment of Biologically Derived Therapeutic Proteins: European Medicines Agency, committee for medical products for human use (CHMP), April 2008.
法规对免疫原性检测的要求越来越严，开发的方法学需要有良好游离药物耐受性，控制基质效应最小化。MSD开发的方法学达到并超出所有上述要求。2019年日本株式会社提供使用Meso Scale Discovery公司的电化学发光(ECL)法的免疫原性测定服务，在测定方法的选择，标识抗体的合成，测定的条件研究及设定，验证，检体测定等方面都提供了与可靠性标准及GLP对应的服务。
 

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方法：MSD不同试剂组合可以开发多种灵活的方法学形式。
 

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优势：
免疫原性金标准，获FDA，EMEA等法规推荐
经过大量临床实验使用和CRO验证，合规性最佳，符合GXP要求
可建立基于细胞水平的中和抗体实验
药物研发必备仪器：MSD飞克级别超敏多因子电化学发光分析仪
 

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