无细胞治疗领域的宠儿---外泌体

在此次抗疫工作中，干细胞应用于新冠肺炎，临床治疗取得了良好成果。使得干细胞的研究成为焦点，其中间充质干细胞因具有多向分化、免疫调节、分泌细胞外囊泡体等特点应用更为广泛。越来越多的研究表明，间充质干细胞来源外泌体与间充质干细胞有着相似的功能，包括修复与再生组织、抑制炎症反应及调节机体免疫等，但外泌体相对于间充质干细胞有更稳定，更好保存，易于控制的优势。因此间充质干细胞外泌体的相关研究进入更多人的视线，期待MSCs外泌体更多的研究成果，带来更先进的疾病医疗手段。小优也整理了几篇相关文献

文章一
Exosomes Derived From miR-133b-Modified Mesenchymal Stem Cells Promote Recovery After Spinal Cord Injury.
 

文章

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研究间充质干细胞外泌体介导的miRNA-133的递送对SCI治疗。作者将miR-133b包装到间充质干细胞分泌的外泌体中。诱发大鼠脊髓损伤（SCI）后，向其尾静脉注射miR-133b外泌体，与对照组相比miR-133b外泌体激活了ERK1/2，STAT3和CREB（参与神经元存活和轴突再生的信号通路蛋白）显著改善SCI后后肢运动功能的恢复。
 

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注射mir-133b外显子可减少SCI后病变体积，保留Neun神经元

 

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miR-133b外泌体对GAP43，NF，RhoA，pERK1 / 2，p-CREB和p-STAT3表达水平的影响。Western印迹显示，miR-133b外泌体增加了GAP43（a）和NF（b）的表达，降低了RhoA（c）的表达，并且促进SCI后受损脊髓中的ERK1 / 2（d），CREB（e）和STAT3（f）的磷酸化

文章二
Thrombin Preconditioning of Extracellular VesiclesDerived from Mesenchymal Stem Cells AcceleratesCutaneous Wound Healing by Boosting TheirBiogenesis and Enriching Cargo Content.
 

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研究了间充质干细胞(MSC)的细胞外囊泡体(EV)用于创面修复的最佳预处理方式。作者通过用凝血酶（40 U），H2O2（50 µM），脂多糖（1 µg / mL）或低氧（10％O2）预处理MSC衍生的EV，通过Elisa测量蛋白来定性定量评估EV分泌，通过检测体外人脐带血内皮细胞（HUVEC）的增殖，迁移和管形成，定量皮肤伤口愈合程度来评估EVs的治疗功效。得出凝血酶预处理可最佳地提高EV的产生，并丰富EV中包括血管内皮生长因子和血管生成素的各种生长因子。凝血酶预处理可通过pERK1/2和pAKT信号通路在体外最佳的增强HUVEC的增殖，迁移和管形成，并在体内加速皮肤伤口愈合方面最有效。和其他几种处理方式比较表现出最佳的治疗效果。
 

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带有多种预处理的MSC的内体和表征EV。分别用凝血酶（40 U），低氧（10％O2），LPS（1 µg）或H2O2（50 µM）预处理MSC。
（A）MSC的代表性TEM图像。在凝血酶预处理组中，在细胞膜附近大量观察到许多外泌体（黑色箭头），而在其他组中则稀疏地观察到（上图）。尽管在所有预处理组的MSC中都很好地观察到了内体（星号），但在凝血酶处理的MSC中观察到的EV数量更多（下图）
（B）在MSC中用CellLight早期内体-GFP标记的早期内体。内体用GFP（绿色）标记，核用DAPI（蓝色）标记。
（C）使用Zetasizer的外泌体的粒度分布。Y轴表示EV的数量，X轴表示通过Zetasizer分析的EV的尺寸
（D）在各种预处理条件下培养的MSC分离出的EV的平均大小。（n = 5）
（E）从以各种预处理状态培养的MSC中分离出的EV的代表性SEM（左图）和TEM（右图）
（F）代表来自MSCs和MSC来源的EV的细胞器标记蛋白的Western blot，代表线粒体标记的细胞色素C，代表核标记的原纤维蛋白，代表Golgi装置标记的GM130和代表外泌体标记的CD63和CD9

 

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在不同的伤口模拟环境刺激后，外泌体包含各种细胞因子和趋化因子。从经凝血酶（40 U），LPS（1 µg），H2O2（50 µM）或低氧（O2 10％）预处理的MSC中分离出EV。
（A）蛋白质组分析仪人血管生成阵列（PPHAA）的EV蛋白质货物的代表性X线胶片印迹分析（上图）及其代表的图表，通过用与天真的小组。灰色的点线表示比纯稚组增加了三倍
（B）在外泌体中通过多重ELISA测定的血管生成素，血管生成素-1，VEGF和HGF的水平。使用单向方差分析（ANOVA）进行统计分析。星号（*）表示与纯电动车相比p <0.05，数字符号（＃）表示与10％氧气处理的电动车相比p <0.05，双匕首（‡）表示与H2O2-相比p <0.05治疗的EV组，与LPS治疗的EV组相比，美元符号（$）表示p <0.05（每次分析n = 5）

 

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从体内相同数目的MSC（5×105）分离出的EV的伤口愈合能力比较。用生理盐水，天真外泌体，10％O2外泌体，凝血酶（40 U）外泌体，LPS（1 µg）外泌体或源自相同数量MSC的H2O2（50 µM）外泌体局部打孔。
（A）体内代表性的连续伤口图像
（B）治疗2、4、6和8天后的相对伤口闭合率（％）
（C）在每次处理后四天和八天，对切开的伤口组织匀浆中的TNF-α和IL-6β进行细胞因子分析。数据表示为平均值±SEM。使用单向方差分析（ANOVA）进行统计分析。星号（*）表示与盐水相比p <0.05，数字符号（＃）表示与纯电动车组相比p <0.05（每次分析n = 4）

间充质干细胞外泌体的相关研究还有很多，例如：含有miR-140-5p的滑膜间充质干细胞来源外泌体(SMSC-Exo)可影响软骨组织再生；骨髓间充质干细胞来源外泌体携带的miR-196a可调节成骨细胞分化促进大鼠颅骨缺损的骨再生。外泌体还可作为疾病诊断标记物、调控靶细胞功能、参与细胞生物学活动等。相关实验展开如：高质量的外泌体分离与干细胞的培养都是研究的关键。

外泌体提取方法对比

 

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参考文献
    LI D, ZHANG P, YAO X, et al. Exosomes Derived From miR-133b-Modified Mesenchymal Stem Cells Promote Recovery After Spinal Cord Injury. Front Neurosci. 2018;12:845.

    LOU G H，CHEN Z，ZHENG M，et al． Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a new therapeutic strategy for liver diseases［J］． Exp Mol Med，2017，49( 6) : e346．

    Dong Kyung Sung , Yun Sil Chang.Thrombin Preconditioning of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells Accelerates Cutaneous Wound Healing by Boosting Their Biogenesis and Enriching Cargo Content［J］J. Clin. Med. 2019, 8, 533.

    罗雅馨，毕浩然.间充质干细胞来源外泌体与再生医学：无细胞疗法临床应用的未来.［J］中国组织工程研究，2020，24(19):3055-3062.

    杜月，顾永卫.间充质干细胞外泌体作为药物递送载体的研究进展［J］中国药学杂志 2020,1 ,55 (1)，1-7.