CELL：肿瘤免疫怎样研究？高分文章方法详解！

自2018年肿瘤免疫获得了诺贝尔生理学或医学奖以来，肿瘤免疫一直是研究的大热门，在国自然基金的申请和中标也增量客观。肿瘤免疫的研究可以从肿瘤微环境，肿瘤免疫逃逸机制，免疫检查点，肿瘤免疫相关通路进行研究。
今天小编就为大家带来一篇来自耶鲁大学Lieping Chen教授在2019年发表在Cell上面的文章“Fibrinogen-like protein 1 is a major immune inhibitory ligand of LAG3”，文章逻辑清晰，论证缜密，希望能为大家带来新的思路。文章干货较多，建议收藏哦！

LAG3（Lymphocyte-activation gene 3）是一个主要在活化的T细胞上表达的跨膜蛋白。LAG3受到IL-2和IL-12的激活，作为一个受体来传递抑制性信号。LAG3可以抑制性的调节CD8和CD4 T细胞的增殖，激活，效应功能和稳态。本篇文章作者通过研究发现，纤维蛋白原样蛋白1（fibrinogen-like protein 1,FGL1），一个肝脏分泌蛋白，是一个不依赖于MHC-II的LAG3的主要的功能性配体。FGL1抑制抗原特异性T细胞激活，FGL1沉默会促进T细胞免疫。此外，血浆中FGL1高表达和抗PD-1/B7-H1治疗不良预后有关。作者的研究表明了一个免疫逃逸新机制和癌症治疗的新应用。
 

Graphical Abstract

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PART1   FGL1是一个LAG3高亲和性的配体

作者使用了GSRA（Genome-Scale Receptor Array）技术来寻找LAG3的结合蛋白，通过Fc标记的LAG3胞外结构域进行筛选。结果表明FGL1是LAG3的主要结合蛋白（Fig.1a and Fig.1b）。作者用流式和BIAcore进一步验证，也表明FGL1和LAG3有相互作用。FGL1/LAG3相互作用的亲和力为1.5nM（Fig.1c and Fig.1d）。
 

Fig.1 a-d  FGL1是一个LAG3的配体蛋白

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FGL1包含了两个结构域，coil-coil domain（CCD）和fibrinogen-like domain（FD）。通过结构域突变研究，作者发现FD，而不是CCD结构域和LAG3有相互作用（Fig. S1e）。LAG3蛋白包含4个Ig-like胞外结构域，D1-D4。D3-D4结构域的去除不影响FGL1的结合，而D1或者D2结构域的分别去除会部分降低结合，表明D1和D2结构域对于FGL1/LAG3的结合都发挥重要作用（Fig. 1e）。

之前的研究表明LAG3 D1结构域的C端单点突变（Y73F）会干扰MHC-II结合。然而，该位点突变不会影响FGL1的结合，表明FLG1/LAG3的相互作用和MHC-II/LAG3的结合无关（Fig. 1e）。LAG3过表达的293T细胞预孵育C9B7W（LAG3的中和抗体，可以结合LAG3的D2结构域而不影响FGL1/MHC-II相互作用），引起FGL1/LAG3的相互作用完全中止（Fig. 1f）。LAG3过表达的细胞加入MHC-II融合蛋白也没有降低FGL1/MHC-II相互作用（Fig. S1f）。
 

Fig.1 e-f  FGL1是一个LAG3的配体蛋白

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Fig.S1 e-f  FGL1/LAG3相互作用研究

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综上表明，FGL1和LAG3的相互作用不依赖于MHC-II，而且这个相互作用涉及到FGL1的fibrinogen-like结构域和LAG3的D1-D2结构域。

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PART2  FGL1在体外和体内通过LAG3抑制抗原介导的T细胞反应

LAG3在静止的T细胞上不表达，但是可以在多种抗原刺激的情况下被上调。通过流式分析发现，FGL1融合蛋白不能结合静止的T细胞，但是可以和野生型小鼠的激活的T细胞结合，而不能结合LAG3-KO的小鼠的激活的T细胞（Fig. 2a）。在anti-CD3刺激的情况下，FGL1可以部分抑制野生型脾脏T细胞的增殖，而这个抑制在LAG3-KO的脾脏T细胞中被减弱，表明FGL1的抑制作用依赖于LAG3（Fig. 2b）。

同时，FGL1剂量依赖性的抑制LAG3过表达的3A9 T细胞的IL-2的抗原特异性诱导，相比于低内源性LAG3表达的亲代3A9 T细胞（Fig. 2c）。作者构建了一个针对于FGL1的中和抗体（177R4），可以阻滞FGL1与LAG3过表达的T细胞结合。177R4和C9B7W都能阻止3A9-LAG3细胞中FGL1对IL-2诱导的抑制（Fig. 2d）。CD8+ OT-1转基因的T细胞转染至同源的小鼠中，使用鸡的卵清蛋白多肽抗原免疫，通过检测到血浆水平TNF-α and IFN-γ的上调表明，FGL1中和抗体177R4显著促进抗原特异性的OT-1 T细胞的激活，效果等同于LAG3中和抗体（Fig. S2c-d）。 

Fig.2 a-d  FGL1调节LAG3依赖的T细胞抑制

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Fig.S2 c-d  FGL1中和抗体增强体外的抗原特异性T细胞反应 

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综上表明，FGL1是一个LAG3的抑制性配基。

PART 3  Fgl1缺陷的小鼠缓慢的发展自发的自身免疫系统症状

作者构建了一个FGL1-KO的小鼠系。在野生型小鼠中，FGL1 mRNA在肝脏中被检测出而不是在其他组织或者造血细胞中。可溶的FGL1在小鼠血液中被检测出，而不能在FGL1-KO的小鼠的血浆或者肝脏中被检测出来（Fig. S3b-c）。

FGL1-KO的小鼠具有正常的外观，器官大小和繁殖，表明FGL1不能总体的影响小鼠生长和发育。然而40%的FGL1-KO小鼠在8个月之后会出现自发性皮炎，显示出皮肤中的淋巴细胞浸润（Fig. S3d-e）。在14-16个月，5/8的雌性FGL1-KO小鼠，没有雄性小鼠，在血浆中抗双链DNA自身抗体的水平增加，相比于野生型小鼠（Fig. S3f）。这些发现和FGL1是一个免疫抑制性分子的功能相一致。
 

Fig.S3 b-f  FGL1-KO小鼠自身免疫表现

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为了评估KO小鼠中免疫系统的总体变化，作者用mass cytometry（CyTOF）描绘了小鼠的外周血细胞。作者检测了全部的CD45+造血细胞，其中central memory-like CD8+ T细胞亚群（cluster 14–15, CD44+ CD62L+ Ly6C+ CD127med Tbet+ Eomes+）有显著的增加，而两个B细胞亚群（cluster 2 and 4）下降（Fig. 3a-e）。
 

Fig.3 a-e  FGL1-KO小鼠免疫细胞表型

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这些结果表明内源的FGL1不影响小鼠的发育和生长，而可能参与自身免疫的调节和免疫稳态的调节。

PART 4  在小鼠模型中Fgl1的沉默促进T细胞免疫对抗肿瘤生长

FGL1-KO和LAG3-KO小鼠皮下接种同系的小鼠MC38结肠癌细胞。和LAG3-KO的小鼠一样，FGL1-KO的小鼠和正常小鼠相比肿瘤生长速度明显减慢（Fig. 4a）。而FGL1和LAG3中和抗体也显著减慢了MC38小鼠结肠细胞和Hepa1-6小鼠肝脏细胞的生长（fig. 4c）。相反，FGL1和LAG3中和抗体的抗肿瘤效应在Rag1-KO C57BL/6小鼠（缺乏T细胞和B细胞）中无效（Fig. 4d）。进一步验证发现，在MC38肿瘤模型中，用特定的抗体中和CD8+ 或者 CD4+ T细胞，可以完全的消除FGL1和LAG3中和抗体的抗肿瘤效应，表明这些中和抗体的抗肿瘤效应依赖于CD8+和CD4+ T细胞。

为了排除LAG3其他的配基与FGL1作用影响LAG3中和抗体的抗肿瘤效应，作者在FGL1-KO的小鼠中验证LAG3中和抗体。在野生型小鼠中，LAG3中和抗体抑制了MC38肿瘤生长，而这个抗肿瘤的效应再FGL1-KO的小鼠中被消除（Fig. 4e）。而这种效应也依赖于LAG3，因为FGL1中和抗体在LAG3-KO小鼠中对肿瘤生长也没有额外的影响（Fig. 4f）。因此，FGL1中和抗体的抗肿瘤效应依赖于LAG3，而LAG3中和抗体的效应依赖于FGL1而不依赖于MHC-II或者LAG3的其他配基。这些结论表明FGL1是一个LAG3的主要配基来诱导T细胞抑制作用和免疫逃逸。
 

Fig.4 a-f  在小鼠模型中FGL1/LAG3相互作用的消除抑制肿瘤生长

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流式实验分析表明，在FGL1-KO的肿瘤中，CD45+白细胞数量明显增加，其中CD44+ CD62L- PD-1+ Gata3+ effector memory-like CD4+ TIL和CD44+ Ly6C+ memory-like CD8+ TIL数量明显增加（Fig. 5b-e）。相反，Treg NK或者B细胞没有明显改变（Fig. 5b-e）。
 

Fig.5 a-e  在FGL1-KO小鼠中肿瘤浸润T细胞的增殖

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综上表明，通过转基因敲除或者中和抗体使FGL1/LAG3沉默会促进肿瘤免疫，通过在肿瘤微环境中刺激T细胞扩增和优先激活。

PART 5  高血浆FGL1和病人在anti-PD治疗中效果更差有关

为了检测FGL1抑制肿瘤免疫是否不依赖于B7-H1/PD-1通路，作者检测了在转移性NSCLC病人中，血浆基准FGL1水平和B7H1/PD-1阻滞治疗（anti-PD）中的关联。作者发现，更高的血浆FGL1水平和NSCLC病人anti-PD治疗效果更差有关（Fig. 6e）。结果表明，FGL1/LAG3相互作用独立于B7-H1/PD-1通路，潜在的引起在人癌症中anti-PD治疗抵抗。

作者进一步使用了MC38肿瘤模型检测在B7-H1/PD-1通路阻滞存在的情况下anti-FGL1/anti-LAG3的作用。对于第6天接种MC38肿瘤的小鼠使用中和抗体进行处理。如果单独使用，anti-FGL1，anti-LAG3和anti-B7-H1抗体会减缓肿瘤生长和少量延长存活率（Fig. 6g）。然而，anti-FGL1或者anti-LAG3抗体和anti-B7-H1抗体联用会显著的提高存活率和降低肿瘤负荷，和使用单个抗体治疗相比（fig. 6g-h）。
 

Fig.6 d-h  在人癌症中FGL1的上调和不良预后有关

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综上表明，FGL1/LAG3通路是一个独立的肿瘤免疫逃逸机制，阻断其相互作用和anti-PD疗法具有协同作用。

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