视频素材来源于JOVE https://www.jove.com/v/60346/prostate-organoid-cultures-as-tools-to-translate-genotypes-mutational
版权归原作者所有
前列腺是产生精液的雄性生殖系统的腺体。雄激素受体（AR）信号对于前列腺发育和体内平衡以及前列腺癌的发生和发展至关重要。
众所周知，前列腺（癌症）研究因缺乏合适的体外模型系统而受到阻碍。
尽管强大的体内模型可用于前列腺研究，但这些模型通常昂贵，费时且在技术上具有挑战性。
△点击放大图片
实验步骤
- 1
- 2
- 3
-
获取小鼠前列腺类器官培养物
1. 处死至少8周龄的雄性小鼠。
2. 分离出泌尿生殖系统。
3. 通过切割血管和结缔组织，在尿道根部切开切口，去除精囊。
4. 切除前列腺附近的输精管。
5. 通过在尿道根部附近切开膀胱来除去膀胱。
6. 轻轻切去残留的囊泡和脂肪组织。
7. 分离尿道。小心地拉动前列腺小叶，使它们不再附着在尿道上。
【关键步骤：壶腹被认为不是前列腺的一部分。大体解剖与前列腺非常相似。壶腹位于前列腺的两个前叶之间。不要隔离该部分。】
8. 单独隔离每个瓣（前端前列腺（AP），腹侧前列腺（VP），背外侧前列腺（DLP）），或者采用整个前列腺继续进行。
9. 用手术刀在10厘米培养皿中将前列腺（小叶）切成小块（约1mm3 ）。
10. 在15 ml Falcon管，用5 mg/ml胶原酶II和10 µM Y-27632在37°C条件消化前列腺1–1.5 h，约50 mg切碎的组织使用1 ml的5 mg/ml胶原酶II。
11. 采用adDMEM / F12 + / + / +补充至10 ml，以洗涤一次。
12. 在4°C，150 g离心5分钟。
13. 吸出上清液，将沉淀物重悬于1 ml的TrypLE中，并加入10 µM Y-27632，37°C消化约15分钟。
【关键步骤：每5分钟用移液器上下吸移，以确保消化效率。】
14. 用adDMEM / F12 + / + / +溶解至10 ml，并在4°C，150 g离心5分钟，以洗涤一次。
15. 吸出上清液，然后将消化的组织放入预冷的基质胶中（基质胶蛋白浓度约为75％）。上下移液5至10次以混合。
【关键步骤：迅速操作，以确保Matrigel不会过早固化，请勿将Matrigel稀释得太多倍数。】
16. 用血细胞计数器计数细胞，并在24孔培养皿的一个孔中央以40µl滴加20,000个细胞。平均一个前列腺可以产出25个基质胶滴。
【关键步骤：组织培养板应预热（37°C过夜）。】
17. 将培养皿放入37°C培养箱中培养15分钟，以使Matrigel固化。【关键步骤：将培养板倒置放置在培养箱中，以防止粘附在培养板底部。】
18. 轻轻将500µl预热（37°C）并添加有10 µM Y-27632的小鼠前列腺培养基加入每个孔中。
19. 每2–3天更新一次培养基。 -
小鼠前列腺类器官传代培养
21. 大约7天后收获类器官，并转移到15ml Falcon管中。
22. 使用过火的玻璃移液器研磨来分离类器官。玻璃移液器的开口大约0.5-1mm。
23. 离心管中上下吸移15-20次。
24. 加入5 ml预冷的adDMEM / F12 + / + / +以溶解残留的基质胶。
25. 在4°C，150 g离心5分钟。
26. 吸出上清液。
27. 将沉淀物重悬于160 µl Matrigel中，以40 µl将Matrigel滴入24孔板皿的中央。
28. 将培养皿放入37°C培养箱培养15分钟，以使Matrigel固化。
【关键步骤：将培养板倒置在培养箱中，以防止粘附在培养板底部。】
29. 轻轻将500 µl预热的（37°C）小鼠前列腺培养基添加到每个孔中。采用过火的玻璃移液器，将类器官分解为细胞团（TrypLE处理可得到高百分比的单细胞）。
30. 每2–3天更新一次培养基。 -
参考文献
P.S.以上实验步骤均来自文献总结，仅供参考
1. Sato T, Clevers H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 2013; 340:1190‒1194. [PubMed: 23744940]
2. Sato T, et al. Single Lgr5 stem cell build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009; 459:262‒265. [PubMed: 19329995]
3. Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 2011; 141:1762‒1772. [PubMed:21889923]
4. Jung P, et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat. Med. 2011; 17:1225‒1227. [PubMed: 1892181]
5. Barker N, et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 2010; 6:25‒36. [PubMed: 20085740]
6. Huch M, et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 2013a; 32:2708‒2721. [PubMed: 24045232]
7. Huch M, et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 2013b; 494:247‒250. [PubMed: 23354049]
8. Boj S, et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 2015; 160:324‒338. [PubMed: 25557080]