4.1 组织染色

从类器官培养物中除去培养基，并用1X PBS轻轻洗涤。

在室温下，用15-20ml的4%PFA(1.00496)将类器官Matrigel圆顶固定在10cm的盘子中30-60分钟。

注意:Matrigel在PFA中固定后会部分溶解。

偶尔旋转盘子以分离Matrigel圆顶并从Matrigel中释放类器官。

注意:并非所有类器官都将从Matrigel中释放。

将15-20ml的固定液从10cm的皿中倒入50ml的锥形管中，使类器官因重力而沉降在管的底部(约10-15分钟)。

在通过重力将类有机物沉降到50ml锥形管的底部后，小心地抽吸固定液，以免在此过程中抽吸出类有机物沉淀。

将15-20ml的1X PBS加入第4步中的培养皿中，在室温下放置15-20分钟。

15-20分钟结束后，旋转培养皿以进一步分离Matrigel圆顶，然后将1X PBS倒入装有步骤5中的类器官沉淀的50ml锥形管中。

再重复三遍步骤5-7。

吸出溶液而不损害类器官沉淀，并通过分配在装有类器官沉淀的50ml锥形管的侧面并加入5ml 1X PBS，并使管旋转以重悬类器官沉淀。

注意:请勿使用移液器上下移液。这将破坏大多数类器官。

直接将5ml含有类器官块的1X PBS倒入10厘米的未分离类器官基质胶圆顶的培养皿中。

向50ml锥形管中再加入5ml 1X PBS，以收集尽可能多的类器官块，然后将其与类器官直接倒入10cm的培养皿中。

如果不立即使用，请用封口膜密封10cm的培养皿，并将其在4°C的冰箱中存放1个月。准备进行免疫荧光染色时，请从冰箱中取出10厘米长的装有固定类器官的培养皿，并在解剖显微镜下进行观察。

切下1毫升移液器吸头的吸头，使桶足够大，可以吸取类器官，而不会剪切或破坏它们。将类器官(1-4)转移到8孔腔玻片中，并用P-200移液器除去残留的1X PBS。避免吮吸类器官，并通过未切割的P-200尖端剪切它们。

用0.5ml的封闭缓冲液(5%马血清+0.5%Triton X-100在1X PBS中)透化固定的类器官，在4°C过夜或在室温下2-4小时。

注意:建议使用与第二抗体宿主相同物种的血清。用P-200移液器从装有类器官的腔室载玻片上除去封闭缓冲液。避免通过P-200吸头吸取类器官。

在封闭缓冲液中准备一抗(300-500μL)或直接偶联抗体(300-500μL)。

将稀释的抗体添加到适当标记的含有类器官的孔中。

允许在4°C下孵育过夜。

第二天，用1X PBS洗涤3次，每次洗涤10-15分钟。

注意:如果使用直接偶联的抗体，样品准备在共聚焦显微镜上成像。

如果使用未偶联的一抗，请在封闭缓冲液中制备二抗(300-500μL)，并标记适当的样品。允许在4°C下用二抗染色过夜。

第二天，用1X PBS洗涤3次，每次洗涤10-15分钟。

用P-200移液器从每个含有类器官的孔中除去封闭缓冲液。避免通过P-200吸头吸取类器官。

通过在1X PBS中加入5μg/ml的DAPI(每个样品300-500μL)来准备核染色。向每个样品中添加DAPI染色溶液，并在室温下孵育15-20分钟。

每次洗涤用1X PBS洗涤3次，每次10-15分钟。

样品准备在共聚焦显微镜上成像

P.S.以上实验步骤均来自文献总结，仅供参考

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