尺寸排阻色谱根据外泌体和杂质粒子的尺寸不同进行分离。用于尺寸排阻色谱的色谱柱中填充有多孔的凝胶颗粒，样品流经色谱柱，尺寸大于凝胶颗粒孔径的物质不能进入孔径，经过凝胶颗粒之间的缝隙洗脱出来，而尺寸小于凝胶颗粒孔径的物质则会进入凝胶颗粒内部的孔道，洗脱所需的时间延长。
在外泌体的分离纯化中，外泌体尺寸较大，先洗脱出来，游离蛋白等杂质尺寸较小，所需洗脱时间更长，从而与外泌体分离。
下方实验步骤： 以SmartSEC™ Mini EV Isolation System为例
图4. 传统尺寸排阻色谱 （此图重新画，以免侵权
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SBI采用新型专用的SmartSEC 尺寸排阻技术。它提供了尺寸排除和亲和相互作用模式的双重功能。在单一的树脂介质中结合这两种模式，消除了经典SEC的耗时和劳动密集型的过程。在SmartSEC中，多孔珠的内部核心以亲和相互作用模式功能化，可以捕获和保留可达400 kDa（15-20 nm）的蛋白质杂质，如IgG和白蛋白。珠子的外壳是惰性的，这最大限度地减少了非特异性结合。
图5. SmartSEC bead 技术 和EVs 纯化机制
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图6. SmartSEC 技术纯化示意图。生物液体，如血清或血浆，应用于预洗的SmartSEC beads，提供有足够的分离缓冲液，在室温下旋转彻底混合和结合30分钟。孵育后，在500 x g下离心1 min，回收分离的EVs。洗脱过的EVs已准备好用于任何下游应用。
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图7. 实验流程示意图
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实验步骤
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样本制备
1. 收集生物液体，3000×g离心15分钟，清除细胞碎片
2. 10000-12000×g下差异离心15分钟去除大囊泡（可选）
3. 在进行EVs纯化之前，使用隔离缓冲液调整样品体积至100µL -
EVs纯化
1. 取SmartSEC 柱（存储缓冲液中包含树脂）。松开盖子（不要从柱中取下），然后关闭bottom closure。
2. 将SmartSEC 柱放入空的收集管中。
3. 500 xg离心30秒，去除存储缓冲液。
4. 取下盖子，添加200µL的隔离缓冲液。
5. 500 xg离心30秒，清洗珠子。
6. 丢弃收集管
7. 将bottom closure放回柱上，并将样品涂在树脂床上。
8. 将盖子放上；将试管放置在旋转平台/搅拌器上，在室温下持续混合30 min。
9. 取下盖和bottom closure，将柱放入新的1.5 ml eppendorf管（未提供）离心机中，500 xg离心30秒，以收集第一部分EVs
10. 向SmartSEC 柱添加100µL的隔离缓冲液。
11. 将SmartSEC 柱放入入一个新的1.5 ml eppendorf管中，500 xg离心30秒，收集第二部分EVs
12. 为了最大限度地提高EVs的回收率，重复步骤10-11，收集第三部分EVs（F3）。
13. 如有需要，在将所有的EVs汇集在一起之前，请分别分析每个部分。大部分EVs将集中在前两个部分。 -
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技术优势
支持快速和便利的纯化
具有高效捕获杂质能力
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