4.3.2 鉴定外泌体特定蛋白-磁珠

实验材料
96 well clear plate (8 well strips) and covers 
Capture Antibody pre-coupled with magnetic beads 
Wash buffer (20X stock) 
Exosome Elution Buffer 
Clearing reagent (to dissolve elution reagent away from exosomes) 
Exo-FlowMag96 magnetic 96- well rack (sold separately) 

 

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1.  向提供的96孔板中，每个孔中加入20µL抗体和磁珠
2.  加入50µL浓缩的、分离的外泌体，或直接将血清样品装入每个孔中，总体积为70µl
3.  在室温下的摇床上孵育过夜，以捕获外泌体
4.  将样品放在Exo-FlowMag96磁性96井架上2分钟
5.  将clear plate放在磁架上，转移出上层清液。确保不要干扰在底部的磁珠
 

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6、从磁力架上取出96孔板，轻轻加入50µL 1X洗涤缓冲液（由提供的20Xstock稀释而成）
7、上下移液混合3次，在室温摇床上孵育5分钟
8、重复步骤4-6，总共清洗2次
9、去除多余的洗涤缓冲液后，然后向96孔板的每个孔中加入100µl 的外泌体洗脱缓冲液
10、在室温下的摇床上孵育1小时
11、将样品板放在磁力架上2分钟
12、小心地取出含有洗脱的完整外泌体的上清液，然后转移到冰上的新鲜试管中。确保不要干扰磁珠。然后丢弃磁珠。免疫纯化的外泌体在4°C以上可稳定数天，可以在-80°C下冷冻以长期保存

实验步骤以ExoFlow-ONE EV Labeling Kit for Flow Cytometry (Ruby Red)为例，货号：EXOF100A-1）
试剂盒组成：
 

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建议：使用前翻转滴瓶混合size reference beads。添加1滴到使用0.02µm过滤器预先过滤的500µL 1xPBS中
1、在使用0.02µm过滤器预过滤的500μL PBS中重悬200-500μg蛋白当量的外泌体
2、将1μL的标记染料加入到外泌体中，在37℃下振荡孵育20分钟
3、对样品进行流式细胞仪分析。
标记的外泌体现在已经准备好用于流式细胞仪分析。ExoFlow-ONE染料具有膜透性，在外泌体内化后被荧光激活；缓冲液中残留的游离染料没有显示出任何可检测的背景。如果需要去除游离染料，建议采用以下可选流程（包括试剂）
1.  在溶液中加入167μL ExoQuick-TC，4℃孵育2小时 
2.  以10000rpm旋转10分钟，使外泌体沉淀
3.  小心地从试管出抽取出上清液
4.  使用0.02µm过滤器与过滤的500μL PBS重悬外泌体，并进行流式细胞仪分析。

Exo-Check Exosome Antibody Array
特点：
灵敏--只需 50 µg 的外泌体蛋白即可进行检测
方便-包括八种已知外泌体标记物的抗体
灵活-与大多数外泌体分离方法兼容，包括ExoQuick®系列试剂和超速离心法
完整--包括细胞污染对照、背景对照（空白点）和用于 HRP 检测的标记阳性对照
半定量--可用于评估特定样本中某些外泌体标记物的相对丰度

 

图 3 A guide to our Exo-Check Exosome Array antibodies
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图 4 血清样本检测结果
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ExoFlow-ONE EV Labeling Kits
特点：
通过特异性标记 EV 内部组件直接检测 EV
利用专有的 ExoFlow-ONE 染料，实现近乎单个囊泡的可视化
高效
未与 EV 结合时背景信号极低
准确估计标记 EV 的大小，内含标准品确保数据

 

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