5.1.2 外泌体RNA纯化

准备好纯化后的外泌体样本，不超过200uL。

加入5倍体积的QIAzol Lysis Reagent（见下表的配比说明）。涡旋混匀或吸打混匀。

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将装有裂解液的管子在室温下(15–25°C) 静置5 min。

加入3.5 µL miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control (1.6 x 108 copies/µl working solution)，充分混匀。按照说明精确配比miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control的储存液和工作液。

加入与起始样本等量的氯仿，盖紧盖子详。涡旋或振荡15 s。 充分混匀对随后的分相非常重要。 

室温(15–25°C) 下静置2-3 min。

4°C 下12,000 x g 离心15 min。离心后，将离心机加热至室温(15–25°C) 。离心后，样本分为3层：上清，无色水相，含有RNA；白色中间层；红色底层，有机相。 

将水相转入一个新的收集管（为提供）。避免在转移时介入其他杂质。加入1.5 倍体积的无水乙醇，反复吸打几次充分混匀。不用离心。立即进行第9步。加 入乙醇后可能会有沉淀产生，但不会影响后续结果。 

吸取700 µL样本，包括可能出现的沉淀，加在1 个RNeasy MinElute spin column上（柱子已经放在1 个2 ml的收集管里，收集管试剂盒提供）。轻轻盖上盖子，室温(15–25°C) 下8000 x g (10,000 rpm)离心 15 s。丢弃流出液（含有 QIAzol Lysis Reagent 或Buffer RWT，不能与漂白剂共存），留着该收集管继续第10步操作。

重复第9步，加入剩下的样本。丢弃流出液（含有 QIAzol Lysis Reagent 或 Buffer RWT，不能与漂白剂共存），留着收集管继续第11步。 

加入700 µL Buffer RWT至柱上。轻轻盖上盖子，室温(15–25°C) 下8000 x g (10,000 rpm)离心 15 s清洗柱子，丢弃流出液（含有 QIAzol Lysis Reagent 或 Buffer RWT，不能与漂白剂共存），留着收集管继续第12步。

吸取500 µL Buffer RPE于柱上。轻轻盖上盖子，室温(15–25°C) 下8000 x g (10,000 rpm)离心 15 s清洗柱子，丢弃流出液。留着收集管继续第13步。

吸取500 µL 的80% 乙醇于柱上。轻轻盖上盖子，室温(15–25°C) 下8000 x g (10,000 rpm)离心 2 min清洗柱膜。丢弃收集管和流出液。 注意：80% 乙醇须以ethanol (96–100%)和RNase-free water配制。

将柱子放在一个新的2 mL收集管（提供）上。打开盖子，全速离心5 min，干燥柱膜。丢弃收集管和流出液。 

将柱子转移入一个新的1.5 ml的收集管（已提供）。加入14 µL RNase-free water于膜中心。小心盖上盖子，1 min下全速离心洗提RNA。最少可加10 µL RNase-free water，用来获得更高浓度的RNA，但是产量会减少20%左右。不要加少于10 µL的RNase-free water，因为柱膜不能得到充分湿润。 柱子的死体积为2 µL：加入14 µL RNase-free water可获得12 µL的洗提液。