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5.2.1  NGS-mRNA建库

| 5.2.2 NGS-miRNA建库

外泌体中包含丰富的miRNA、lncRNA、circRNA,所以近年来外泌体逐渐成为科学研究的热点领域。
如下操作步骤以产品货号180773的步骤为例,产品列表详见右下方推荐产品

实验步骤

  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 7
  • 1

    mRNA 富集

    开始前的要点

    · 该方案经过优化,可富集源自所有具有 poly-A 尾的真核物种的 RNA


    · 推荐的总 RNA 输入量为 100 ng – 1 µg


    ·200 µl 中的 mRNA 富集” 用于使用 200 µl 试管 96 孔板富集 mRNA。可参看附录(附录的内容可从QIAGEN官网下载货号为180773的产品全部说明书进行了解)。


    开始前要做的事情

    · 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。


    · 在第一次使用前涡旋 Pure mRNA Beads 3 分钟或在后续使用前涡旋 1 分钟


    · 将水浴或加热块加热至 70°C,并将缓冲液 OEB 加热至 70°C


    · 除非另有说明,否则所有操作步骤步骤(包括离心)均应在室温下进行。


    程序: 1.5 ml 管中富集 mRNA
    1.  涡旋 Pure mRNA Beads 1 分钟以彻底重悬。


    2.  根据准备富集反应表 2。短暂离心、涡旋并再次短暂离心。

    表 2. 富集反应设置

    零件 体积/反应
    总 RNA (100 ng – 1 µg) 可变
    RNase 抑制剂 1 µl
    缓冲 mRBB 250µl
    彻底重悬的 Pure mRNA Beads 25µl
    无核酸酶水 使总反应体积达到 526 µl
    总容积 526 µl


    3. 70°C 下孵育 3 分钟,然后在室温下孵育 10 分钟


    4.  短暂离心,然后将试管放在磁性架上。溶液清除后(约 2 分钟),弃去上清液。


    5.  添加 400 µl 缓冲液 OW2。涡旋,短暂离心,然后将试管放在磁性架上。溶液澄清后,弃去上清液。


    6.  重复步骤 5


    7.  添加 50 µl 缓冲液 OEB。涡旋,短暂离心,并在 70°C 下孵育 3 分钟


    8.  将样品从 70°C 中取出并在室温下放置 5 分钟


    9.  添加 50 µl Buffer mRBB 并涡旋。短暂离心,室温孵育 10 分钟


    10.  短暂离心,然后将试管放在磁性架上。溶液澄清后,小心弃去上清液。将任何残留液体留在管中,以尽量减少珠粒损失


    11.  添加 400 µl 缓冲液 OW2。涡旋,短暂离心,并将试管放在磁性架上。溶液澄清后,弃去上清液。


    12. 29 µl 加热至 70°C Buffer OEB 添加到珠粒中,然后涡旋。


    13.  短暂离心,将管子放在磁性架子上。溶液澄清后,将 27 µl 上清液转移到干净的试管中。上清液含有富集的 poly(A)+ RNA


    14.  继续 ”方案:片段化/FastSelect RNA 去除”。或者,样品可以储存在 –90 至 –65°C

  • 2

    片段化/FastSelect RNA 去除

    开始前的要点

    · 整个 27 µl 产品来自“操作步骤:mRNA 富集”是片段化/FastSelect RNA 去除的起始材料。


    · FastSelect 去除珠蛋白 mRNA单独出售,参见“订购信息”) 建议在从全血样本中富集 mRNA 时使用。


    · 为了生成最佳插入大小,需要根据 RNA 的质量和来源确定每个实验的片段化时间。遵循中的建议表 4


    程序
    1.  在冰上解冻先前富集的 mRNA。轻轻混合,然后短暂离心以收集管壁上的残留液体,然后放回冰上。


    2.  准备 RNA 片段化和 QIAseq FastSelect 珠蛋白 mRNA 去除所需的试剂。
        2a.在室温下从适当的 QIAseq FastSelect RNA Removal Kits 中解冻 RT Buffer、5x、Nuclease-Free Water 和试管。
        2b.通过涡旋混合,然后短暂离心以收集管侧面的残留液体。


    3.  在冰上,根据表3。短暂离心,上下吹打混合 10 次,然后再次短暂离心。
        注意:如果设置多个反应,则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%

     

    表 3. 片段化/RNA 去除反应的设置

    零件 体积/反应
    mRNA 富集反应(已在试管中) 27µl
    RT 缓冲液,5x 8µl
    QIAseqFastSelect–Globin* 1 µl
    ERCC控制† 可选的
    无核酸酶水 1µl
    总容积 37 µl

    *来自 QIAseq FastSelect RNA 去除试剂盒。如果没有执行,请添加 1 µl 无核酸酶水。


    4.  如中所述孵育表 4,根据您输入的 RNA 质量和插入片段的大致大小。

    表 4. 片段化/RNA 去除方案

    输入 RNA 质量 插入大小 ~150–250 bp 插入大小 ~350 bp
    高品质 (RIN >9) 1* 95°C 15 分钟 95°C 下 3 分钟
    中等质量 (RIN 5–6) 1* 95°C 10 分钟 95°C 下 3 分钟
    FFPE 或降解样品 (RIN <3) 1* 无碎片† 无碎片†
    重要提示:如果执行 FastSelect Globin mRNA Removal,则仅包括步骤 2-9 使用 FastSelect –Globin 时执行步骤 2-9,无论输入 RNA 质量如何。无论 RNA 是否高质量,都需要执行它们,中等质量、FFPE 或退化。 2 75°C 下 2 分钟 75°C 下 2 分钟
    3 70°C 下 2 分钟 70°C 下 2 分钟
    4 65°C 下 2 分钟 65°C 下 2 分钟
    5 60°C 下 2 分钟 60°C 下 2 分钟
    6 55°C 下 2 分钟 55°C 下 2 分钟
    7 37°C 下 2 分钟 37°C 下 2 分钟
    8 2 分钟,25°C 2 分钟,25°C
    9 保持在 4°C 保持在 4°C

    *根据输入的 RNA 质量和所需的插入大小,为第 1 步选择一个选项。
    也适用于大小在 80-500 bp 之间的外泌体 RNA 或其他来源的 RNA


    5.  立即进行“操作步骤:第一链合成”.

  • 3

    第一链合成

    开始前的要点

    · 整个 37 µl 产品来自“方案:片段化/FastSelect RNA 去除”是第一链合成的起始材料。


    · 在冰上建立第一链合成。


    · 不要涡旋任何第一链合成试剂或反应。


    · 使用带加热盖的热循环仪。


    · 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。


    · 确保 QIAseq Beads 始终完全混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟,只需涡旋磁珠即可。


    程序
    1.  准备第一链合成所需的试剂。

        1a.在室温下解冻 1 M DTT
        1b.轻弹试管混合。
        1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。
        注意:RT EnzymeRNase Inhibitor 应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后,立即将酶放回冰箱。


    2.  1 M DTT 稀释至 0.4 M 用于表 5


    3.  在冰上,根据表 5。短暂离心,上下吹打混合 10 次,然后再次短暂离心。
        注意:如果设置多个反应,则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%

     

    表 5. 第一链反应的设置

    零件 体积/反应
    片段化/RNA去除反应(已在试管中) 37µl
    稀释 DTT (0.4 M) 1µl
    逆转录酶 1µl
    核糖核酸酶抑制剂 1µl
    总容积 40 µl


    4.  如中所述孵育表 6

     

    表 6. 第一链操作步骤

    温度 孵化时间
    1 25 °C 10 分钟
    2 42°C 15 分钟
    3 70°C 15 分钟
    4 4°C 抓住


    5.  加入 56 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。


    6.  在室温下孵育 5 分钟


    7.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后(约 10 分钟或更长时间),小心取出并丢弃上清液。
        重要提示:不要丢弃磁珠,因为它们含有感兴趣的 DNA


    8.  试管仍在磁力架上,加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。


    9.  重复乙醇洗涤。
        重要提示:第​​二次洗涤后,彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇,然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。


    10.  管/板(盖打开)仍然在磁性支架上,在室温下风干 5-10 分钟
        注意:目视检查颗粒是否完全干燥并且所有残留的乙醇都已蒸发。


    11.  从磁性支架上取下管/板。加入 40 µl Nuclease-Free Water 从磁珠中洗脱 DNA。通过移液充分混合。


    12.  将管/板放回磁架,直到溶液清除。


    13.  转移 38.5 µl 上清液至清洁管/板。


    14.  继续 ”方案:第二链合成、末端修复和 A 加成”。或者,可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

  • 4

    第二链合成、末端修复和 A 加成

    开始前的要点

    · 整个 38.5 µl 产品来自“操作步骤:第一链合成”是第二链合成、末端修复和A-加成过程的起始材料。


    · 在冰上建立反应。


    · 不要涡旋任何第二链合成、末端修复和 A 加成试剂或反应。


    · 使用带加热盖的热循环仪。


    · 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。


    · 确保 QIAseq Beads 始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟,只需涡旋磁珠即可。


    程序
    1.  准备所需的试剂。
        1a.在室温下解冻第二股缓冲液,10x

        1b.通过涡旋混合。
        1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。
        注意:Second Strand Enzyme Mix 应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后,立即将酶放回冰箱。


    2.  在冰上,根据表 7。短暂离心,上下吹打混合 10 次,然后再次短暂离心。
        注意:如果设置多个反应,则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%

    零件 体积/反应
    产品来自“操作步骤:第一链合成” 38.5µl
    第二链缓冲液,10x 5µl
    第二链酶混合物 6.5µl
    总容积 50µl

    表 7. 第二链合成、末端修复和 A 加成反应的设置

    3.  如中所述孵育表 8

     

    表 8. 第二链合成、末端修复和 A 加成方案

    温度 孵化时间
    1 25 °C 30分钟
    2 65°C 15 分钟
    3 4°C 抓住


    4.  添加 70 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。


    5.  在室温下孵育 5 分钟


    6.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后(约 10 分钟或更长时间),小心取出并丢弃上清液。
        重要提示:不要丢弃磁珠,因为它们含有感兴趣的 DNA。


    7.  试管仍在磁力架上,加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。


    8.  重复乙醇洗涤。
        重要提示:第​​二次洗涤后,彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇,然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。


    9.  管/板(盖打开)仍然在磁性支架上,在室温下风干 5-10 分钟
        注意:目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。


    10.  从磁力架上取下试管/板,加入 52 µl Nuclease-Free Water 从磁珠中洗脱 DNA。通过移液充分混合。


    11.  将管/板放回磁架,直到溶液清除。


    12.  转移 50 µl 上清液至清洁管/板。


    13.  继续 ”操作步骤:链特异性连接”。或者,可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

  • 5

    链特异性连接

    开始前的要点

    · 整个 50 µl 产品来自“方案:第二链合成、末端修复和 A 加成”是链特异性连接的起始材料。


    · 在冰上建立反应。


    · 不要涡旋任何链特异性连接酶或反应。


    · 使用没有加热盖的热循环仪。


    · 对于 UDI 转接板24-plex 96-plex 板的布局在“附录 答:QIAseq 双指数 Y 型适配器”。 QIAseq Unique Dual-Index Kits 中使用的索引基序列于www.qiagen.com


    · 对于 CDI 转接板,布局和条形码序列在附录 A 中进行了描述。


    · 未使用、未稀释的适配器可储存在 –30 至 –15°C。如果需要,可以在板储存前取出并丢弃残留的稀释适配器。
      重要提示:请勿重复使用稀释的适配器,因为存在条形码交叉污染的风险稀释材料储存后接头浓度低于预期。


    · 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。


    · 确保 QIAseq Beads 始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟,只需涡旋磁珠即可。


    程序
    1.  准备所需的试剂。
        1a.在室温下解冻 Ultralow Input Ligation Buffer、4x Ligation Initiator

        1b.通过涡旋混合。
        1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。
        注意:超低输入连接酶应在使用前从冰箱中取出并放在冰上。使用后,立即将酶放回冰箱。


    2.  如下准备转接板。 24-plex 96-plex 一次性转接板的布局显示在附录 A 中。
        注意:如果多路复用 1-6 个样本,请参阅 Illumina 的富集操作步骤的 Low-Plex Pooling Guidelines 文档以选择理想的适配器组合。
        2a.在室温下解冻转接板。使用前短暂涡旋和离心。
        2b.取下透明的保护适配器板盖,小心地仅刺穿每个要使用的适配器孔的箔密封,使用新的尖端刺穿每个孔。
        2c.按照中的建议取出等分试样并稀释接头表 9

    表 9. QIAseq 接头的稀释

    总 RNA 输入量 适配器稀释
    100 纳克 1:100
    500 纳克 1:25
    1µg 1:12.5
    5µg 1:5


        2d.更换板盖并将未使用的、未稀释的适配器冷冻在 –30 至 –15°C。在板储存前取出并丢弃残留的稀释适配器。

    3.  在冰上,根据表 10。短暂离心。上下吹打 15-20 次混合并再次短暂离心。
        注意:如果设置多个反应,则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 10%
        重要提示:移液器缓慢混合。连接引发剂和反应混合物非常粘稠。

     

    表 10. 链特异性连接反应的设置

    零件 体积/反应
    产品来自“方案:第二链合成、末端修复和 A 加成” 50µl
    稀释适配器* 2µl
    超低输入连接缓冲液,4x 25µl
    超低输入连接酶 5µl
    连接引发剂 6.5µl
    无核酸酶水 11.5µl
    总容积 100µl

    *为每个样品选择一个独特的适配器。

    4.  25°C 下孵育 10 分钟
        重要提示:请勿使用加热的盖子。


    5.  添加 80 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。


    6.  在室温下孵育 5 分钟


    7.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后(约 10 分钟或更长时间),小心取出并丢弃上清液。
        重要提示:不要丢弃磁珠,因为它们含有感兴趣的 DNA


    8.  试管仍在磁力架上,加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。


    9.  重复乙醇洗涤。
        重要提示:第​​二次洗涤后,彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇,然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。


    10.  管/板(盖打开)仍然在磁性支架上,在室温下风干 5-10 分钟
        注意:目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。


    11.  从磁力架上取下试管,加入 92 µl Nuclease-Free Water 从磁珠中洗脱 DNA。通过移液充分混合。


    12.  将管/板放回磁架,直到溶液清除。


    13.  90 µl 上清液转移到清洁的管/板中。


    14.  添加 108 µl 重悬的 QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。


    15.  在室温下孵育 5 分钟


    16.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后(约 10 分钟或更长时间),小心取出并丢弃上清液。
        重要提示:不要丢弃磁珠,因为它们含有感兴趣的 DNA


    17.  试管仍在磁力架上,加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管/板 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。


    18.  重复乙醇洗涤。
        重要提示:第​​二次洗涤后,彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇,然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。


    19.  管/板(盖打开)仍然在磁性支架上,在室温下风干 5-10 分钟
        注意:目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。


    20.  从磁力架上取下试管/板,加入 25 µl Nuclease-Free Water,从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。


    21.  将管/板放回磁架,直到溶液清除。


    22.  将 23.5 µl 上清液转移到干净的试管/板上。


    23.  继续 ”操作步骤:CleanStart 文库扩增”。或者,样品可以储存在 -30 至 –15°C 的恒温冰箱中

  • 6

    CleanStart 文库扩增

    开始前的要点

    · 整个 23.5 µl 产品来自“操作步骤:链特异性连接”是 CleanStart Library Amplification 的起始材料。


    · QIAseq CleanStart PCR 试剂使用专有的 PCR 反应,结合修饰酶,确保去除之前构建的 NGS 文库。重要:如果需要重新扩增之前扩增的 CleanStart 文库 - 例如,当需要额外的文库来替换失败的 NGS 运行时 - 省略 PCR 协​​议的净化步骤(在 37°C 下孵育 15 分钟)以禁用选择性降解。


    · 在冰上建立反应。


    · 不要涡旋任何 CleanStart 文库扩增试剂或反应。


    · 使用带加热盖的热循环仪。


    · 确保 QIAseq Beads 在使用前达到室温。


    · 确保 QIAseq Beads 始终充分混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟,只需涡旋磁珠即可。


    程序
    1.  准备 CleanStart 文库扩增所需的试剂。
        1a.在室温下解冻 CleanStart PCR Primer Mix,然后在冰上解冻 2x CleanStart PCR Mix
        1b.轻弹试管混合。
        1c.离心机从管的侧面收集残留的液体。


    2.  在冰上,根据表 11。短暂离心,上下吹打混合 10 次,然后再次短暂离心。
        注意:如果设置多个反应,制备的预混液体积比反应总数所需的量大 10%

    表 11. 文库扩增设置

    零件 体积/反应
    产品来自“操作步骤:链特异性连接” 23.5 µl
    CleanStart PCR 混合液,2x 25µl
    CleanStart PCR 引物混合物 1.5µl
    总容积 50µl


    3.  根据总 RNA 输入选择 PCR 循环数,根据表 12
        重要提示:使用 QIAseq FastSelect –Globin Kit 去除珠蛋白 mRNA 时,需要进行 2 个额外的文库扩增循环。

    表 12. 基于总 RNA 输入的推荐 PCR 循环数

    总 RNA 输入 扩增循环数*
    100 纳克 14–16†
    500 纳克 11–13†
    1 µg 9–11†
    5 µg 7–9†

    *使用表 13 中选定的扩增循环数。
    重要提示:当使用 QIAseq FastSelect -Globin RNA Removal 去除珠蛋白 mRNA 时,需要进行 2 个额外的文库扩增循环。

    4.  如中所述孵育表 13

    表 13. CleanStart 文库扩增循环条件

    时间 温度 循环次数
    CleanStart 去污* 15 分钟 37°C 1
    初始变性 2 分钟 98°C 1
    聚合酶链反应 20 s 98°C 看表 12
    30 s 60°C
    30 s 72°C
    最终延期 1分钟 72°C 1
    抓住 4°C 抓住

    *对于文库的重新扩增,省略 CleanStart 去污步骤并开始在 98°C 下孵育 2 分钟

    5.  扩增后,加入 60 µl QIAseq Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。


    6.  在室温下孵育 5 分钟


    7.  将管/板放在磁性架上。溶液清除后(约 10 分钟或更长时间),小心取出并丢弃上清液。
        重要提示:不要丢弃磁珠,因为它们含有感兴趣的 DNA


    8.  将管/板仍在磁力架上,加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管子 3 次以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。


    9.  重复乙醇洗涤。
        重要提示:第​​二次洗涤后,彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心,然后将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇,然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。


    10.  管/板(盖打开)仍然在磁性支架上,在室温下风干 5-10 分钟
        注意:目视检查颗粒是否完全干燥并且所有乙醇都已蒸发。


    11.  从磁力架上取下试管/板,加入 22 µl Nuclease-Free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。


    12.  将管/板放回磁架,直到溶液清除。


    13.  转移 20 µl 以清洁试管/板。这是 QIAseq 链式测序文库。


    14.  继续 ”建议:文库 QC、定量和测序”。或者,可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

  • 7

    文库 QC、定量和测序

    NGS 文库质控
    QC 可以使用安捷伦生物分析仪或 TapeStation 进行。检查库片段的大小分布是否正确(中值大小约为 300–500 bp)以及是否缺少适配器或适配器二聚体(~130 bp)。图 3显示了从 UHRR 输入材料制备的 1 ng 50 ng 文库的文库大小分布。两个结果都没有显示适配器二聚体的痕迹。 1 ng 输入 RNAseq 文库显示最佳大小分布,而 50 ng 输入 RNAseq 文库显示更广泛的文库大小分布(但不影响 NGS 测序质量)。




    图 3. QIAseq Stranded RNAseq 文库大小分布,使用安捷伦生物分析仪高灵敏度 DNA 芯片在标准方案条件和不同输入量下测量。左:1 ng,右:50 ng UHRR 输入材料。

    △点击放大图片


    重要提示:如果在文库 QC 后出现过多的接头二聚体 (~130 bp)(超过文库总产量的 1-2%),请使用 QIAseq 珠进行第二次纯化。这可以通过使样品达到 55 µl 的最终体积并重复步骤来完成5–13 CleanStart 文库扩增。

    首选文库量化方法
    Bioanalyzer TapeStation 的文库产量测量依赖于嵌入 DNA RNA 的荧光染料。这些染料无法区分带有或不带有接头序列的 cDNA,因此只能对具有完整接头序列的完整 QIAseq Stranded mRNA Select 文库进行测序。因此,强烈建议使用 QIAGEN QIAseq Library Quant Array Kit Assay Kit,其中包含经过实验室验证的正向和反向引物以及 DNA 标准品,用于对制备的 QIAseq Stranded mRNA Select 文库进行准确定量。

    样品稀释、汇集、测序和数据分析
    使用 QIAseq Library Quant Array Assay Kit 对 QIAseq Stranded 文库进行定量后,典型的 QIAseq Stranded 文库产量在 20 µl 体积中约为 8–10 nM,具体取决于所使用的输入起始 RNA 的质量。该产量足以进行 NGS 测序运行。将单个 QIAseq 链库稀释至 4 nM 的浓度。然后,以等摩尔量将具有不同样本索引的库组合起来。加载到 MiSeq®上的混合 QIAseq 链库的推荐起始浓度为 9 pM,而在 NextSeq 上为 1.6 pM

    mRNA 富集样本的推荐起点是 25 M 读数/样本。使用 UDI 时,需要 74 bp 双末端读取和双 10 bp 索引读取。使用 CDI 时,需要 76 bp 双末端读取和双 8 bp 索引读取。对于稀有/新型转录本、剪接位点异构体,建议使用更长的双末端读取(UDI 文库:149 bp 双末端读取和双 10 bp 索引读取,以及 CDI 文库:151 bp 双末端读取和双 8 bp 索引读取)和融合基因检测。

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