5.2.2 NGS-miRNA建库

开始前的要点
· 处理细胞和组织样本时，推荐的总 RNA 起始量为 100 ng。

· 在处理血清和血浆样本时，如果使用 miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit 或 miRNeasy Serum/Plasma Kit 处理了 200 µl 血清/血浆，建议的总 RNA 起始量为 5 µl RNA 洗脱液。当使用 exoRNeasy 试剂盒处理 1 ml 血清/血浆时，推荐的总 RNA 起始量为 5 µl RNA 洗脱液。

· 当处理低总 RNA 输入量或血清/血浆样本时，QIAseq miRNA 3' Adapter 必须根据表 2。

· 在冰上设置 3' 连接反应，按列出的顺序添加组件。

· 3' 连接反应非常粘稠。要混合，请缓慢而彻底地移液（上下移液至少 15-20 次）。

· 不要涡旋 QIAseq miRNA RI、QIAseq miRNA 3' 连接酶、模板 RNA 或 3' 连接反应。

· 完成 3' 连接反应后，立即进行“操作步骤：5' 连接”.

程序
1.  在冰上解冻模板 RNA。轻轻混合，短暂离心以收集管壁上的残留液体，然后放回冰上。

2.  准备 3' 连接反应所需的试剂。在室温 (15–25ºC) 下解冻 QIAseq miRNA 3' 接头、QIAseq miRNA 3' 缓冲液、连接激活剂和无核酸酶水。通过轻弹试管混合每种溶液。短暂离心管子以收集管子侧面的任何残留液体并保持在室温下。

    使用前从 -30 至 -15ºC 冰箱中取出 QIAseq miRNA RI 和 QIAseq miRNA 3' RNA 连接酶，然后置于冰上。使用后立即将两种酶放回冰箱。

3.  如果使用低 RNA 输入或血清/血浆样本，请根据表 2使用无核酸酶水稀释 QIAseq miRNA 3' 接头。短暂离心，上下吹打混合 12 次，然后再次短暂离心。

表 2. QIAseq miRNA 3' 接头的稀释

模板 RNA 输入（总 RNA）	适配器稀释
500 纳克	使用未稀释
100 纳克	使用未稀释
10 纳克	稀释 1:5
1 ng	稀释 1:20
血清/血浆	稀释 1:5

4.  在冰上，准备 3' 连接反应根据表3。短暂离心，上下吹打 15-20 次混合，然后再次短暂离心。
    重要：混合反应时缓慢移液。连接激活剂非常粘稠。
    注意：如果设置了多个反应，则准备的 Master Mix 的体积比反应总数所需的量大 10%。

表 3. 3' 连接反应的设置

零件	体积/反应
无核酸酶水	可变
QIAseq miRNA 3' 适配器*	1 µl
QIAseq miRNA RI	1 µl
QIAseq miRNA 3' 连接酶	1µl
QIAseq miRNA 3' 缓冲	2µl
连接激活剂	10 µl
模板 RNA（在步骤中添加5)	可变†‡
总容积	20µl

* 对于低输入量和血清/血浆 RNA，QIAseq miRNA 3' Adapter 必须根据表 2。
†对于细胞和组织样本，推荐的总 RNA 起始量为 100 ng。
‡对于血清/血浆样本，当使用 miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit 或 miRNeasy Serum/Plasma Kit 处理 200 µl 血清/血浆时，推荐的总 RNA 起始量为 5 µl RNA 洗脱液。当使用 exoRNeasy 试剂盒处理 1 ml 血清/血浆时，推荐的总 RNA 起始量为 5 µl RNA 洗脱液。

5.  将模板 RNA 添加到每个包含 3' 结扎主混合物的管中。短暂离心，上下吹打 15-20 次混合，然后再次短暂离心。
    重要提示：移液器缓慢混合。反应混合物非常粘稠。

6.  在 28ºC 下孵育 1 小时。

7.  在 65ºC 下孵育 20 分钟。

8.  保持在 4ºC。
    重要提示：在 4ºC 下保持至少 5 分钟。

9.  立即进行“操作步骤：5' 连接“.

开始前的要点
· UDI 5' 适配器随 QIAseq miRNA 12 Index Kit IL UDI 和 QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI 一起提供。
  重要提示：请勿使用 QIAseq miRNA Library Kit 随附的 QIAseq miRNA 5' Adapter。

· 整个 20 µl 3' 连接反应在“操作步骤：3' 连接”是 5' 连接反应的起始材料。

· 将 5' 连接组分直接添加到包含已完成 3' 连接反应的试管中。

· 当处理低 RNA 输入或血清/血浆样本时，UDI 5' Adapter 必须根据表 4。

· 在冰上设置 5' 连接反应，按列出的顺序添加组件。

· 5' 连接反应非常粘稠。缓慢而彻底地吸管（上下吸管 15-20 次）以混合反应。

· 不要涡旋 QIAseq miRNA RI、QIAseq miRNA 5' Ligase 或 5' ligation 反应。

· 完成 5' 连接反应后，立即进行“操作步骤：反向 转录“.

程序
1.  准备 5' 连接反应所需的试剂。在室温下解冻 UDI 5' Adapter（在 QIAseq miRNA 12 Index Kit IL UDI 和 QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI Kits 中提供）和 QIAseq miRNA 5' Buffer。轻弹试管混合。短暂离心管子以收集管子侧面的残留液体并保持在室温下。

    在准备 Master Mix 之前，将 QIAseq miRNA RI 和 QIAseq miRNA 5' Ligase 从 -30 到 -15ºC 的冰箱中取出，然后放在冰上。使用后立即将两种酶放回冰箱。

2.  如果使用低 RNA 输入或血清/血浆样本，请根据表 4使用无核酸酶水稀释 UDI 5' Adapter。短暂离心，上下吹打混合 12 次，然后再次短暂离心。

表 4. UDI 5' 适配器的稀释

模板 RNA 输入（总 RNA）	适配器稀释
500 纳克	使用未稀释
100 纳克	使用未稀释
10 纳克	稀释 1:2.5
1 ng	稀释 1:10
血清/血浆	稀释 1:2.5

3.  在冰上，根据表5准备 5' 连接反应，按列出的顺序添加成分。短暂离心，上下吹打 10-15 次混合，然后再次短暂离心。
    重要：混合反应时缓慢移液。反应混合物非常粘稠。
    注意：如果设置了多个反应，则准备的 Master Mix 的体积比反应总数所需的量大 10%。

表 5. 5' 连接反应的设置

零件	体积/反应
3' 连接反应（已在试管中）	20µl
无核酸酶水	15µl
QIAseq miRNA 5' 缓冲液	2 µl
QIAseq miRNA RI	1 µl
QIAseq miRNA 5' 连接酶	1 µl
UDI 5' 接头*	1 µl
总容积	40µl

* 对于低输入和血清/血浆 RNA，UDI 5' 适配器必须根据表 4 进行稀释。

4.  在 28ºC 下孵育 30 分钟。

5.  在 65ºC 下孵育 20 分钟。

6.  保持在 4ºC。

7.  立即进行“操作步骤：逆转录“.

开始前的要点
· 整个 40 µl 5' 连接反应在“操作步骤：5' 连接“是逆转录反应的起始原料。

· 将逆转录成分直接添加到包含完成 5' 连接反应的试管中。

· 当处理低 RNA 输入或血清/血浆样本时，QIAseq miRNA RT Primer 必须根据表 7。

· 在冰上建立逆转录反应。

· 不要涡旋振荡 QIAseq miRNA RI、QIAseq miRNA RT 酶或逆转录反应。

· 一定要使用 UDI RT Initiator（随 QIAseq miRNA 12 Index Kit IL UDI 或 QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI 提供）。
  重要提示：请勿使用 QIAseq miRNA Library Kit 随附的 QIAseq miRNA NGS RT Initiator。

· 完成逆转录反应后，立即进行“操作步骤： QIAseq miRNA Beads (QMN Beads) 的制备”.
  注意：此操作步骤可以在逆转录反应孵化时执行。

程序
1.  准备逆转录反应所需的试剂。在室温下解冻 UDI RT Initiator（在 QIAseq miRNA 12 Index Kit IL UDI 和 QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI Kits 中提供）、QIAseq miRNA RT Buffer 和 QIAseq miRNA RT Primer。轻弹试管混合。短暂离心管子以收集管子侧面的残留液体，并保持在室温下。
    在制备 Master Mix 之前，将 QIAseq miRNA RI 和 QIAseq miRNA RT Enzyme 从 -30 至 -15ºC 冰箱中取出，并置于冰上。使用后立即将两种酶放回冰箱。

2.  在每个试管中加入 2 µl UDI RT Initiator。短暂离心，上下吹打 15-20 次混合，然后再次短暂离心。

3.  如中所述孵育管表 6。

 

表 6. 使用 UDI RT 引发剂孵育管

时间	温度
2 分钟	75°C
2 分钟	70°C
2 分钟	65°C
2 分钟	60°C
2 分钟	55°C
5分钟	37°C
5分钟	25°C
∞*	4°C

* 保持直到 RT 反应建立。

4.  如果使用低 RNA 输入或血清/血浆样本，请使用无核酸酶水稀释 QIAseq miRNA RT Primer，根据表 7。

表 7. QIAseq miRNA RT Primer 的稀释

模板 RNA 输入（总 RNA）	RT 引物稀释
500 纳克	使用未稀释
100 纳克	使用未稀释
10 纳克	稀释 1:5
1 ng	稀释 1:20
血清/血浆	稀释 1:5

5.  在冰上，根据表 8。短暂离心，上下吹打混合 12 次，然后再次短暂离心。
    注意：如果设置了多个反应，则准备的 Master Mix 的体积比反应总数所需的量大 10%。

表 8. 逆转录反应的设置

零件	体积/反应
5' 连接反应 + QIAseq miRNA RT Initiator（已在试管中）	42µl
QIAseq miRNA RT Primer*	2 µl
无核酸酶的水	2 µl
QIAseq miRNA RT 缓冲液	12µl
QIAseq miRNA RI	1 µl
QIAseq miRNA RT 酶	1 µl
总容积	60µl

* 对于低输入量和血清/血浆 RNA，QIAseq miRNA RT Primer 必须根据表 7。

6.  在 50ºC 下孵育 1 小时。

7.  在 70ºC 下孵育 15 分钟。

8.  保持在 4ºC。
    重要提示：在 4ºC 下保持至少 5 分钟。

9.  继续“方案：QIAseq miRNA Beads (QMN Beads) 的制备”.

开始前的要点
· 该操作步骤准备了 QIAseq miRNA 珠，以下称为 QMN 珠。 QIAseq Beads 使用 QIAseq Bead Binding Buffer 重新缓冲以创建 QMN Beads。

· 重要提示：QIAseq Beads 和随后制备的 QMN Beads 需要是同质的。这需要快速工作并在使用前立即彻底重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需再次涡旋珠子。

· 重要提示：准备后，需要将 QMN 珠放在冰上。

程序
1.  彻底涡旋 QIAseq Beads 和 QIAseq Bead Binding Buffer，以确保磁珠处于悬浮状态并均匀分布。不要离心试剂。
    重要提示：QIAseq Beads 需要是同质的。这需要在使用前立即快速彻底地重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需再次涡旋珠子。

2.  小心地将 400 µl QIAseq Beads（珠子储存缓冲液是粘性的）添加到 2 ml 微量离心管中。这个数量的珠子足以执行“方案：cDNA 清理“以及与一个样品的文库扩增相关的清理。在磁铁架上短暂离心并立即分离珠子。
    注意：可在单个 2 ml 管中一次制备最多 4 个样品（1.6 ml）的珠子。如果同时处理多个样品的微珠，只需按比例增加下面添加的 QIAseq Beads 和 QIAseq Bead Binding Buffer 的量。

3.  当珠子完全迁移后，小心取出并丢弃上清液。
    注意：在此步骤中，可以在管中留下少量上清液。

4.  从磁力架上取下试管，小心吸取（缓冲液是粘性的）150 µl QIAseq Bead Binding Buffer 到磁珠上。彻底涡旋以完全重新悬浮珠粒。短暂离心并立即在磁铁架上分离珠子。

5.  当珠子完全迁移后，小心取出并丢弃上清液。
    注意：在不干扰珠子的情况下，确保已去除尽可能多的上清液。

6.  从磁力架上取下试管，小心地将 400 µl QIAseq Bead Binding Buffer 移到磁珠上（缓冲液是粘性的）。彻底涡旋以完全重新悬浮珠粒。
QMN 珠子的制备现已完成。如果珠子不会立即使用，请将珠子存放在冰上或 2–8°C。
    注意：QMN Beads 可在 2–8°C 下储存长达一周。

7.  继续“方案：cDNA 纯化”.

开始前的要点
· 整个 60 µl cDNA 合成在“操作步骤：逆转录“是清理程序的起始材料。

· 在“方案：QIAseq miRNA Beads (QMN) 的制备 珠子）“ 是清理程序所必需的。

· 珠子清理可以在管或板中进行。使用板时，以 2000 rpm 的转速进行短暂离心 2 分钟。

· 使用无核酸酶水制备新鲜的 80% 乙醇。

· 重要提示：乙醇洗涤后，珠子必须完全干燥。给出了去除过量乙醇的具体建议。

程序
1.  确保 QMN Beads 始终彻底混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需再次涡旋珠子。

2.  离心含有 cDNA 反应的管/板。

3.  将 143 µl QMN Beads 添加到含有 cDNA 反应的管/板中。涡旋 3 秒并短暂离心。
    注意：使用板时，以 2000 rpm 的速度离心 2 分钟。
    注意：如果印版翘曲，请将混合物转移到新印版上。

4.  在室温下孵育 5 分钟。

5.  将管/板放在磁铁架上约 4 分钟或直到珠子完全迁移。
    注意：确保珠子在继续之前已完全迁移。

6.  丢弃上清液并保留珠子。
    注意：不要从磁铁支架上取下管/板。

7.  磁珠仍在磁铁架上，加入 200 µl 80% 乙醇。立即取出并丢弃乙醇洗涤液。

8.  加入 200 µl 80% 乙醇重复洗涤。立即取出并丢弃第二次乙醇洗涤。
    重要提示：在第二次洗涤后彻底清除所有乙醇痕迹。短暂离心（以 2000 rpm 的速度离心板）并将管/板放回磁性支架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

9.  磁珠仍在磁架上，在室温下风干 10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有残留的乙醇都已蒸发。残留的乙醇会阻碍后续文库扩增反应的扩增效率。根据湿度，可能需要延长干燥时间。

10.  磁珠仍在磁力架上，向管/板中加入 17 µl 无核酸酶水，洗脱 DNA。随后关闭/盖上并从磁性支架上取下管/板。

11.  小心上下移液，直到所有珠子完全重新悬浮，短暂离心，并在室温下孵育 2 分钟。

12.  将管/板放回磁架约 2 分钟或直到珠子完全迁移。
    注意：确保珠子在继续之前已完全迁移。

13.  将 15 µl 洗脱的 DNA 转移到新的试管/板中。

14.  继续 ”操作步骤：使用 QIAseq miRNA 进行文库样本索引和扩增 12 标签试剂盒或 QIAseq miRNA 96 标签试剂盒”。或者，可以将完成的 cDNA 纯化产物储存在 -30 至 -15ºC 的恒温冰箱中。

开始前的要点
· 该文库扩增方案使用来自 QIAseq miRNA 12 Index Kit 或 QIAseq miRNA 96 Index Kits 的板 UDI。

· 15 µl 产品来自“方案：cDNA 清理“是文库扩增程序的起始材料。

· 在冰上建立图书馆扩增反应。

· 不要涡旋 HotStarTaq DNA 聚合酶或文库扩增反应。

· 重要提示：在珠子清理过程中，必须在乙醇洗涤步骤后完全干燥珠子。给出了去除过量乙醇的具体建议。

程序
1.  准备文库扩增反应所需的试剂。解冻 QIAseq miRNA Library Buffer 和所需的索引板。通过轻弹管或板进行混合，然后短暂离心管或板以收集管和板侧面的残留液体。
    在制备 Master Mix 之前，将 HotStarTaq DNA 聚合酶从 -30 至 -15ºC 冰箱中取出，并置于冰上。使用后立即将 HotStarTaq DNA 聚合酶放回冰箱。

2.  打开 QIAseq RUDI 索引板并刺穿扩增所需的孔，为每个样本分配一个唯一索引。
    注意：这是一个可刺穿板，在每个孔中都包含一个 i5 和 i7 UDI 对。布局在表 13至表 21。
    注意：在步骤 3 的反应设置过程中，来自 QIAseq RUDI 的组分直接添加到板中。

3.  在冰上，根据表 9。短暂离心，上下吹打混合 12 次，然后再次短暂离心。
    注意：首先添加反应组分，最后添加来自板 QIAseq RUDI 的索引，以便为每个样品分配唯一的双重索引。
    注意：如果设置了多个反应，则准备的 Master Mix 的体积比反应总数所需的量大 10%。

表 9. 使用板索引时文库扩增反应的设置

零件	体积/反应
产品来自“方案：cDNA 清理“	15µl
QIAseq miRNA Library Buffer	10µl
HotStarTaq DNA 聚合酶	1.5µl
来自 QIAseq miRNA 12 或 QIAseq miRNA 96 UDI Index Plate 的 1 个孔的样本索引 *	2µl
无核酸酶水	21.5µl
总容积	50µl

*多达 768 个独特的 QIAseq miRNA UDI 索引可供使用。

4.  根据表 10。正确的循环数取决于原始 RNA 输入，并显示在表 11。

表 10. 文库扩增方案

步	时间	温度
抓住	15 分钟	95°C
3 步循环（看表 11循环数）
变性	15 s	95°C
退火	30 s	60°C
延伸	15 s	72°C
保持	2 分钟	72°C
保持	∞*	4°C

*在 4°C 下保持至少 5 分钟。

表 11. 文库扩增循环

原始 RNA 输入（总 RNA）	周期数
500 纳克	13
100 纳克	16
10 纳克	19
1 纳克	24
血清/血浆	22

5.  将文库扩增反应放入热循环仪并开始运行。
    重要提示：方案完成后，在 4ºC 下保持至少 5 分钟。

6.  热循环仪完成后，短暂离心 50 µl 文库扩增反应管/板，并在每个文库扩增反应中加入 47 µl QMN Beads。
    注意：确保 QMN Beads 始终彻底混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。
    注意：使用板时，以 2000 rpm 的速度离心。
    注意：如果印版翘曲，请将混合物转移到新印版上。

7.  涡旋 3 s 并短暂离心。

8.  在室温下孵育 5 分钟。

9.  将管/板放在磁铁架上大约 4 分钟或直到珠子完全迁移。
    注意：确保珠子在继续之前已完全迁移。

10.  保留上清液，将 92 µl 上清液转移到新的管/板中。丢弃含有珠子的管子。
    重要提示：在此步骤不要丢弃上清液。

11.  向 92 µl 上清液中加入 83 µl QMN Beads。涡旋 3 s 并短暂离心。

12.  在室温下孵育 5 分钟。

13.  将管/板放在磁铁架上，直到珠子完全迁移。
    注意：确保珠子在继续之前已完全迁移。

14.  丢弃上清液并保留珠子。
    注意：不要从磁铁支架上取下管/板。

15.  磁珠仍在磁铁架上，加入 200 µl 80% 乙醇。立即取出并丢弃乙醇洗涤液。

16.  加入 200 µl 80% 乙醇重复洗涤。立即取出并丢弃第二次乙醇洗涤。
    注意：重要的是在第二次洗涤后完全去除乙醇洗涤的所有痕迹。短暂离心并将试管放回磁力架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。

17.  磁珠仍在磁架上，在室温下风干 10 分钟。
    注意：目视检查颗粒是否完全干燥并且所有残留的乙醇都已蒸发。根据湿度，可能需要延长干燥时间。

18.  磁珠仍在磁性支架上，向试管中加入 17 µl 无核酸酶水洗脱 DNA。随后关闭并从磁性支架上取下管子。

19.  小心地上下移液，直到所有珠子完全重新悬浮；短暂离心并在室温下孵育 2 分钟。

20.  将管/板放在磁性支架上约 2 分钟（或直到珠子清除）。
    注意：确保珠子在继续之前已完全迁移。

21.  将 15 µl 洗脱的 DNA 转移到新试管中。这是 miRNA 测序文库。

22.  继续 ”方案：miRNA 文库预测序 QC“。或者，完整的 miRNA 测序文库可以储存在 -30 至 -15ºC 的恒温冰箱中。

开始前的要点
· 来自“Protocol: Library Sample Indexing and Amplification Using QIAseq miRNA 12 Index Kits or QIAseq miRNA 96 Index Kits”的 15 µl miRNA 测序文库的一部分是文库 QC 的起始材料。不使用时，将 miRNA 测序文库存放在冰上。具体的内容请在QIAGEN官网下载货号331502的完整说明书。

· 建议对文库 QC 执行 2 个选项中的 1 个。 “程序：选项 1”涉及使用 Agilent Bioanalyzer 2100。“程序：选项 2”涉及使用 PAGE 凝胶电泳。

程序：选项 1（Agilent Bioanalyzer 2100）
1.  根据制造商的说明，使用高灵敏度 DNA 芯片在安捷伦生物分析仪或 TapeStation 上分析 1 µl miRNA 测序文库。一个 miRNA 大小的文库大约 200 bp，一个 piRNA 大小的文库大约198 个基点。典型的 miRNA 大小的文库结果显示在图 3。

图 3. 使用 QIAseq miRNA Library Kit 制备的 miRNA 大小的文库的 TapeStation 轨迹。

△点击放大图片

2.  如果在大约 157 bp（接头-二聚体）处观察到一个大峰（大于 miRNA 峰高的 25%），或者如果注意到其他不需要的条带，建议对 miRNA 测序文库的剩余部分进行凝胶切除以选择感兴趣的特定库（请参阅“附录 A：文库凝胶大小选择“).附录具体的内容请在QIAGEN官网下载货号331502的完整说明书。
    注意：为防止接头二聚化，请使用 1 ng 或更多的总 RNA，并确保已按所列顺序添加所有反应组分。

3.  继续 ”操作步骤：确定每个库的浓度和读取分配 样本“.

程序：选项 2（PAGE 凝胶电泳）
1.  准备 6% PAGE TBE 凝胶。

2.  在凝胶上加载 3 µl 文库清理产品；使用 25 bp DNA 阶梯作为大小参考。

3.  在 120V 下运行凝胶约 1 小时或直到染料前端到达盒式磁带底部。

4.  拍摄凝胶的图像。一个 miRNA 大小的文库大约为 173 bp，一个 piRNA 大小的文库大约为 181 bp。典型结果显示在图 4。

图 4. 使用 QIAseq miRNA Library Kit 制备的 miRNA 大小的文库的 PAGE 凝胶。

△点击放大图片

5.  如果在大约 150 bp（接头-二聚体）处观察到显着条带，或者如果观察到其他不需要的条带，则对 miRNA 测序文库的其余部分进行凝胶切除以选择感兴趣的特定文库（见“附录a：文库的凝胶大小选择”).
    注意：为防止接头二聚化，请使用 1 ng 或更多的总 RNA，并确保已按所列顺序添加所有反应组分。

6. 继续 ”操作步骤：确定每个库的浓度和读取分配 样本“.

开始前的要点
· 部分 15 µl miRNA 测序文库来自“操作步骤：库样本 使用 QIAseq miRNA 12 标签试剂盒或 QIAseq miRNA 96 进行索引和扩增 索引套件”是图书馆 QC 的起始材料。不使用时，将图书馆存放在冰上。

· 建议使用 Qubit 荧光计来确定文库浓度。

程序
1.  根据制造商的说明，在 Qubit 荧光计上确定 2 µl miRNA 测序文库的浓度。

2.  使用以下等式确定每个样品的摩尔浓度（以 nM 为单位）。该等式适用于 miRNA 大小的文库。

（X ng/μl）（106）/（112450） = Y nM

3.  使用无核酸酶水将单个库稀释至 4 nM。

4.  如果多路复用，以等摩尔量组合文库并充分混合。
    重要提示：建议为每个样本分配 5-1000 万次读取。

开始前的要点
· 稀释的单个或多重 4 nM 文库来自“操作步骤：确定库 每个样本的浓度和读数分配“是测序的起始材料。

· 有关如何变性测序文库和设置测序运行的完整说明，请参阅系统特定的 Illumina 文档。

· QIAseq miRNA UDI 使用定制的 10 bp 独特双样本索引。

为 Illumina 仪器生成样品表
QIAseq RUDI Adapters 的标签序列可在以下网址下载www.qiagen.com。为了使测序准备更加方便，包含所有 QIAseq RUDI Adapter 标签序列的样本表的即用型模板可用于不同的测序仪器，MiSeq、MiniSeq、NextSeq、HiSeq 和 NovaSeq，网址为www.qiagen.com。这些可以使用 Illumina Local Run Manager 或任何文本编辑器导入和编辑。根据您是使用 Local Run Manager 还是手动配置测序运行，请确保下载适用于 Illumina 系统的样品表。

所有 Illumina 仪器

1.  去www.qiagen.com/shop/sequencing/qiaseq-mirna-ngs 并选择 Product Resources > Instrument Technical Documents 以根据您的实验设置查找并下载适当的 QIAseq miRNA UDI 模板。

2.  样品表已包含与仪器一起使用的所有相关信息。

3.  打开 CSV 文件，删除实验中不会使用的所有 UDI 索引，并用新名称保存文件。

4.  将文件复制到 MiSeq 仪器上的“Sample Sheet”文件夹或将“Sample Sheet”上传到 Illumina 仪器的 Local Run Manager：MiSeq、MiniSeq 和 NextSeq。

5.  准备好执行运行时，选择文件。

6.  样品稀释和汇集：将单个文库稀释至 4 nM，NovaSeq 除外；将单个库稀释至 10 nM。然后，如果每个库需要相似的测序深度，则以等摩尔量将具有不同样本索引的库组合起来。
    注意：对于 NovaSeq，最终合并文库浓度建议在 1.0 – 1.5 nM 之间，从而在 NovaSeq 上产生 200 – 300 pM 之间的最终加载浓度。

7.  文库准备和加载：根据特定的 Illumina 仪器指南在 Illumina 仪器上准备和加载混合文库。再次稀释变性文库池，以获得如下文所述的最终文库浓度表 12。

 

表 12. Illumina 仪器推荐的最终文库加载浓度

Illumina测序仪	Illumina 特定文档	最终文库浓度 (pM)
爱尔兰证券交易所	iSeq 100 系统指南	75
米序	MiSeq 系统指南	10
迷你序列	MiniSeq 系统指南	1.2
下一个Seq 500/550	NextSeq 500 系统指南或 NextSeq 550 系统指南	1.2
下一个Seq 1000/2000	nextseq-1000-2000-变性稀释-1000000139235-03	75
诺瓦塞克6000	NovaSeq 6000 测序系统指南	200–300

8.  测序运行设置：选择 FASTQ Only。
推荐的操作步骤是 72 bp 单读取和 10 bp 双索引。如果不希望包含 UMI，则可以使用 50 bp 单次读取操作步骤。

9.  完成测序运行后，继续“操作步骤：数据分析“.

开始前的要点
· 一级和二级分析工具可在geneglobe.qiagen.com 获得。

· RNA-seq Analysis & Biomarker Discovery Pipeline 使用 QIAGEN CLC Biomedical Workbench 进行读取对齐、UMI 计数和差异表达以及 Ingenuity Pathway Analysis 以返回 QIAGEN 知识库中有关规范途径、上游调节因子和疾病的热门信息。

· 使用 RNA-seq 分析和生物标志物发现管道，可以上传 FASTQ 文件，对齐 miRNA 序列并计算 UMI。将使用交互式火山图计算和可视化差异 miRNA 表达。将根据 QIAGEN 知识库查询差异表达的 miRNA，了解经典途径、上游调节因子以及疾病和生物学功能。然后可以识别重要的 microRNA，并且很容易找到数字 PCR 和 qPCR 测定以进行生物学验证。

· 对于每个对齐，都会从您的帐户中扣除一个信用。使用 RNA-seq 分析和生物标志物发现管道的积分包含在 QIAseq 库套件中。也可以购买积分以通过非 QIAGEN 试剂盒使用 RNA-seq 分析门户www.qiagen.com。

· 传统分析管道包含用于读取对齐、UMI 计数和差异表达的在线工具。这些用于数据分析的管道必须同时上传所有数据，并且必须在一个会话中完成读取对齐和 UMI 计数。

 

数据分析步骤
1.  访问geneglobe.qiagen.com/analyze。

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使用您的用户名和密码登录 GeneGlobe。

2.  选择新一代测序、miRNA、QIAseq miRNA Library Kit、RNA-seq Analysis & Biomarker Discovery Pipeline。

3.  单击开始分析。

4.  按照上传测序数据、对齐和计数以及创建实验的 3 个步骤进行操作。单击右上角的帮助可以访问有关如何使用 RNA-seq 分析门户的说明。

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