5.2.3  qPCR

以Absin abs60265为例：
1.  RNA加A尾： 取RNase-free离心管，配制如下混合液：RNase free ddH2O to 20μL、 Poly A 1μL、2xPoly A Buffer 10μL、RNA 10pg~2ug轻轻混匀，37℃ 30min，迅速置于冰上。
2.   RT反应液配制： 上述反应液在使用前5000rpm离心5s：取上述反应液 8μl、2x RT Buffer 10μl 、RTase Mix 2μl用移液器轻轻吹打混匀。
3.  RT反应：
 

△点击放大图片

反应完毕后，5000rpm离心5s，尽快放于冰上，直接进行PCR反应。如暂时不用，请放置于-20°C以下温度，在半年内使用完毕，不要反复冻融。模板如具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55℃。

以Absin abs60269为例：
1、RT 反应液配制：

△点击放大图片

取RNase free 离心管，配制如下混合液：
注：a. RT primer 指 miRNA 茎环逆转录引物；若使用 U6 作为参照时 RT primer 即为 U6-RT primer (2uM)。轻轻混匀，5000rpm 离心5s。
2、cDNA合成反应：

△点击放大图片

反应完毕后，5000rpm 离心 5s，尽快放于冰上，直接进行 PCR 反应，如暂时不用，请放置于-20°C 以下温度，在半年内使用完毕，不要反复冻融。

1、按下表配制反应体系 ：
取RNase-free离心管，配制如下混合液：

△点击放大图片

注：a. Specific Primer 指 miRNA 的上游特异性引物，即由本公司设计的正向引物，一般标注为：xx-miR-X-X-F，该引物可自行设计合成，本公司也可免费提供设计；若使用 U6 作为参照时，Specific Primer 标注为 U6-Forward Primer。
b. Tag Primer 为本公司专用 miRNA 反向引物，若使用 U6 作为参照时，Tag Primer 标注为 U6-Reverse Primer。
2.  设置反应条件：

△点击放大图片

仪器类型不同，熔解曲线采集程序不同，使用仪器默认熔解曲线采集程序即可。

1、配制反应体系 ：
取RNase-free 离心管，配制如下混合液：
 

△点击放大图片

注1：miRNA cDNA模板为 miRNA加尾法逆转录试剂盒的RT产物；
注2：根据所用qPCR仪及使用者偏好，可选择用或不用ROX校正。
2、PCR反应条件：

△点击放大图片

RNA的质量和完整性以及分离方法的效率对于维持任何转录组的表征都是至关重要的。因为miRNAs是非常短的RNA物种，它们在分离和逆转录过程中可能与较长的RNA转录本表现得非常不同。因此，有与内源性mirna密切相似的控制是非常重要的。与内源性miRNAs大小相似，但与任何已识别的miRNAs没有任何同源性的合成rna是理想的对照组。这种对照组的优化混合提供了对低、中、高丰度水平的内源性miRNAs的控制，这密切反映了任何RNA分离方法的保真度或影响。
以SBI的Cat # EVery600B-1 为例
试剂盒包含：两组Spike-in Mix，及5条引物正向引物用于qPCR检测，其中Spkn1, Spkn2, Spkn3 RNA Spike-in Mix用于RNA分离过程，Spkn4, cel-miR-39-3p RNA Spike-in Mix用于cDNA合成步骤。引物需在无酶水中重悬。

△点击放大图片

（1）RNA纯化过程
1.  将Mix（Spkn1、Spkn2和Spkn3）在冰上解冻。使用离心机短暂涡旋混合。建议分装成几等分，保存在-80℃，以避免反复的冻融循环。
2.  使用纯化试剂盒中裂解液对样本进行处理，加入1uL的RNA Spike-in加入样本裂解液中。（不能直接加入样本中！）
3.  按照核酸纯化试剂盒完成以下的步骤。

（2）cDNA合成过程
1. 将Mix（Spkn4 and cel-miR-39-3p）在冰上解冻。使用离心机短暂涡旋混合。建议分装成几等分，保存在-80℃，以避免反复的冻融循环。
2. 在建立逆转录反应时，每20µL RT反应中加入1µL的Mix。后续按照所选试剂盒说明书进行操作。Spkn1, Spkn2 and Spkn3的浓度有100倍差距，他们的CT值区别应该~6.6 Ct。