5.4 外泌体DNA提取

1、在冰上解冻500µL的血浆或血清。如果样品体积小于500µL，则在样品解冻后使用1xPBS将样品体积达到500µL。注：抽血后溶解和/或溶解的白细胞可能释放细胞gDNA。在处理血液样本时，应采取预防措施以稳定白细胞，最大限度地减少样本中细胞gDNA污染
2、3000xg离心15分钟，去除细胞、凋亡小体和细胞碎片并收集上清液（可选：可将上清液通过0.22µm过滤器，去除样品中大于220 nm的微粒）
3、涡旋试剂A溶液，在步骤2的上清液中加入12µL试剂A，涡旋混合10秒，55⁰C孵育10分钟。注：使用试剂A处理不仅可以减少非外泌体蛋白污染物的数量，还可以减少一些外泌体表面标记物的数量和/或大小
4、让混合物冷却到室温。将步骤3中的混合物与128µL的ExoQuick混合
5、搅拌均匀
6、在4⁰C处放置30min
7. 13000xg离心机，持续10分钟
8、取出上清液，将其与沉淀分离。保存上清液（见下文B环节），继续使用外泌体沉淀物进行下一步操作
9、外泌体沉淀物在500µL 1xPBS重悬
10、选中后外泌体可以通过以下步骤提取外泌体DNA（见C环节）

11、将35 mL纯乙醇（99-100%）加入15 mL浓缩洗涤液中，制备50 mL含约70%乙醇和30%洗涤液的工作洗涤液（工作洗涤液应密封严密，可在15-25℃保存）。工作洗涤液将在下面的C环节中使用
12、将1000µL的DNA结合缓冲液加入A环节的上清液中（约630µL），通过涡旋10秒混合
13、取步骤12的混合物600µL转移到collection tube中的spin column中。3300xg离心2分钟。去除液体，用相同的collection tube重新组装spin column
14、重复步骤13，将600µL的剩余混合物从步骤12转移到spin column中
15、重复步骤14，将步骤12中的任何剩余混合物转移到spin column中
16、将600µL的工作洗涤缓冲液加入到与collection tube组装的spin column中，在3300xg下离心1分钟。去除液体，用相同的collection tube重新组装spin column
17、再次重复步骤17次（即，总共清洗两次）
18、在cfDNA洗脱前干燥旋转：为了去除任何残留的工作洗涤缓冲液，将旋转柱在13000xg下离心2分钟。丢弃collection tube
19、将旋转柱从步骤18转移到1.5 mL 离心管中。在旋转柱中加入50µL洗脱缓冲液，室温静置2分钟。将旋转柱与埃彭多夫管一起以400 x g离心1分钟，然后以5800xg.
20、离心2分钟。为了提高回收率，将洗脱缓冲液转移回旋转柱，室温静置2分钟。400 x g离心1分钟，然后5800xg
21、离心2分钟。使用NanoDrop检测分离的cfDNA。由于分离的cfDNA浓度低，片段大小小，OD读数和A260与A280的比值可能都不准确。为了准确估计cfDNA，建议使用Qubit或安捷伦生物分析仪的高灵敏度DNA定量试剂盒来进行检测。cfDNA的产量将根据血液样本来源的不同而不同，预计数量在ng范围内。

1、准备外泌体原液：外泌体从上述方案的A环节获得。外泌体应该存储在1xPBS中，下面进一步的步骤需要500µL的~体积。如果外泌体溶液的体积小于500µL，则使用1xPBS补充到500µL
2、从步骤1中加入1000µL的DNA结合缓冲液到500µL的外泌体溶液中，旋转10秒钟来混合均匀
3、将步骤2中约600µL的混合物转移到collection tube组装的spin column中。3300xg离心2分钟。丢弃气流，用相同的collection tube重新组装spin column
4、重复步骤3，将600µL的剩余混合物从步骤2转移到spin column中
5、重复步骤4，将任何剩余的混合物从步骤2转移到spin column中
6、将600µL的工作洗涤缓冲液加入到与收集管组装的旋转柱中，在3300xg下离心1分钟。丢弃流式，用相同的收集管重新组装旋转柱
7、再次重复步骤7一次（即，总共清洗两次）
8、在外泌体DNA洗脱前干燥旋转（重要）：为了去除任何残留的工作洗涤缓冲液，在13000xg下离心2分钟。丢弃collection tube
9、将spin column从步骤9转移到1.5 mL离心管中。在旋转柱中加入50µL洗脱缓冲液，室温静置2分钟。将spin column与离心管一起以400 x g离心1分钟，然后以5800xg离心2分钟
10、为了提高回收率，将洗脱缓冲液转移回spin column，室温静置2分钟。400 x g离心1分钟，然后5800xg.离心2分钟
11、使用NanoDrop测量测量的cfDNA。由于分离的cfDNA浓度低，片段大小小，OD读数和A260与A280的比值可能都不准确。为了准确估计cfDNA，我们建议使用使用Qubit或安捷伦生物分析仪的高灵敏度DNA分析试剂盒。不同样本的cfDNA产量将根据血液样本的来源而有所不同，预计数量在ng范围内

XCF COMPLETE Exosome and cfDNA Isolation Kit (for Serum and Plasma)
特点：
全面--只需一个试剂盒，就可以从一份血清或血浆样本中获得两种不同来源的生物标记物
省力--只需不到 30 分钟的操作时间
完全兼容-分离的 DNA 可用于大多数下游应用，如 qPCR 和 NGS
清洁-共沉淀蛋白（如白蛋白和 IgG）的携带量极少，可在敏感的下游应用中发挥良好性能
灵活--可选择 XCF COMPLETE 外泌体和 cfDNA 分离试剂盒，其中包括用于分离外泌体和外泌体 DNA 的 ExoQuick；如果您只想从已分离的外泌体中提取外泌体 DNA，则可选择 XCF 外泌体 DNA 分离试剂盒

图 7 The XCF COMPLETE Kit shows low protein carryover
△点击放大图片