7.2 外泌体定量-ELISA法

外泌体纯化

外泌体蛋白当量的推荐投入会根据外泌体分离方法而不同。若使用SBI ExoQuick和ExoQuick-TC产品纯化的外泌体，建议使用1-200μg的蛋白投入量/孔进行ExoELISA检测。 使用1-200μg蛋白当量的外泌体作为每孔投入量。检测信号强度取决于外泌体膜上CD63的表达水平
用涂层缓冲液（足够重复孔）将外泌体（在无菌DPBS中重悬）至120uL

将 ExoELISA-ULTRA 蛋白质标准品在冰上解冻.
先将 ExoELISA-ULTRA 蛋白标准品以 1:1000 的比例稀释在Coating Buffer
中（例如，将 1uL 标准品加入微离心管中的 1uL Coating Buffer）涡旋混合均匀。将此稀释液作为标准曲线的第一标准
在离心管中将第一标准液进行连续稀释。每次稀释后都要涡旋混匀。
用于绘制 ExoELISA-ULTRA 标准曲线的建议稀释倍数如下。
 

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在使用后丢弃稀释后的标准品，切勿冻融或重复使用任何稀释后的标准品

TMB ELISA 底物加入 ELISA 板孔之前，确保将其平衡到室温
用纯净水将 20X 冲洗缓冲液稀释成 1X 工作冲洗缓冲液（每个 8 孔柱大约需要 10 毫升 1X 冲洗缓冲液）。每个 8 孔柱需要约 10 毫升 1X 缓冲溶液）
将 50 µL 新鲜制备的蛋白质标准品（见上文）和外泌体样品加入微孔板的相应孔中，用密封薄膜/盖子盖住微孔板。37ºC 孵育 1 小时
培养步骤结束后，倒转平板，清空所有内容物。
用 100 µL 1X 洗板缓冲液洗板 3 次，每次 5 分钟。
- 建议使用微孔板摇床进行所有后续清洗和孵育步骤。
- 将微孔板放在干净的纸巾上用力拍打，清除残留液体，注意不要让孔完全干。
用阻断缓冲液稀释 CD63 一抗 1:200，每孔加入 50 µL，37 °C 孵育 1 小时，用 100 µLl 1X 洗板缓冲液洗板 3 次，每次 5 分钟。
用阻断缓冲液稀释二抗 1:5,000，每孔加入 50 µL，37 °C 孵育 1 小时。，用 100 µL 1X 洗板缓冲液洗板 3 次，每次 5 分钟。
加入 50 µL 超敏 TMB ELISA 底物，室温下振荡孵育 5-15 分钟，震荡，加入 50 µL 终止缓冲液，立即读取
使用Spectrophotometric plate reader用450 nm波长进行定量结果