8.2.2 外泌体工程化-内源性装载-miRNA克隆

在培养皿进行外泌体供体细胞铺板，使用与细胞兼容的培养基，24小时后达到60-70%的融合度，并确保使用无外泌体胎牛血清培养基，将细胞放回培养箱进行培养。
24小时后，将XMIR or AXMIR寡核苷酸与所选择的转染试剂混合，并按照适当的方案来实现细胞的转染。阳性对照寡核苷酸最终浓度为20 nM 进行共转染实验。通过荧光显微镜和qPCR可以分别观察和定量RNA oligo的转染，具体步骤如下（以SBI的转染试剂PureFection 货号LV750A-1为例）

a.    在6孔板细胞密度为70-80%时进行转染。5 μL纯染试剂+ 30 μL XMIR/AXMIR RNA oligo（10uM）+200 uL无血清培养基形成转染复合物
b.    通过短暂的涡旋混合，在室温下孵育15分钟。
c.    将转染复合物加入到6孔细胞中，最终每个孔的培养基总体积为3 mL，培养基中XMIR/AXMIR RNA寡核苷酸的最终浓度为100 nM
d.    XMIR/AXMIR RNA寡核苷酸的数量可以根据您的实验条件进行增加或减少

将细胞送回培养箱，让外泌体产生24小时
在培养皿中，将目标细胞进行铺板，让其能在24小时后，得到下游实验所需的细胞密度

转染24小时后，取出细胞培养基，放入15 mL或50 mL的离心管中
在1：5体积的细胞培养基中加入ExoQuick-TC
倒置混合，在4°C下孵育过夜
在室温或4°C下，以3000xg旋转离心管30分钟（温度不影响外泌体产量）。弃上清液，在100 uL PBS中重悬外泌体
在Nanodrop上使用A280测量外泌体的产率。调整浓度至1 ug/uL
将外泌体加入到含有目标细胞的细胞培养皿中。
在目的细胞中进行所需的检测，以分析外泌体介导的miRNA or Anti-miRNA递送的影响

货号 XMIR-POS
有两种主要方式：在荧光显微镜上观察目标细胞，或(2) qPCR。 
在荧光显微镜上观察靶细胞：将外泌体加入到目标细胞2小时后，可以使用荧光显微镜上设置的标准RFP滤光片观察转染
qPCR：转染24小时后，将外泌体加入目标细胞后，可从细胞裂解液中提取RNA，并使用SBI的SeraMir试剂盒（货号：RA820A-1）进行qRT-PCR分析，我们的阳性对照寡核苷酸可以使用尖突插入正向引物检测，您的XMIR或AXMIR可以使用针对其序列的正向引物检测。